বিস্তৃত প্রোটিওমিক্স মস্তিষ্ক-ভিত্তিক সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড বায়োমার্কারকে উপসর্গবিহীন এবং উপসর্গবিহীন আলঝাইমার রোগে প্রকাশ করে

আল্জ্হেইমার্স ডিজিজ (AD) এর প্রোটিন বায়োমার্কারের অভাব রয়েছে যা এর একাধিক অন্তর্নিহিত প্যাথোফিজিওলজিকে প্রতিফলিত করে, রোগ নির্ণয় এবং চিকিত্সার অগ্রগতিকে বাধা দেয়। এখানে, আমরা সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) বায়োমার্কার সনাক্ত করতে ব্যাপক প্রোটিওমিক্স ব্যবহার করি যা AD প্যাথোফিজিওলজির বিস্তৃত পরিসরের প্রতিনিধিত্ব করে। মাল্টিপ্লেক্স ভর স্পেকট্রোমেট্রি যথাক্রমে AD CSF এবং মস্তিষ্কে প্রায় 3,500 এবং আনুমানিক 12,000 প্রোটিন সনাক্ত করেছে। মস্তিষ্কের প্রোটিওমের নেটওয়ার্ক বিশ্লেষণে 44টি জীববৈচিত্র্য মডিউল সমাধান করা হয়েছে, যার মধ্যে 15টি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড প্রোটিওমের সাথে ওভারল্যাপ করা হয়েছে। এই ওভারল্যাপিং মডিউলগুলিতে CSF AD মার্কারগুলিকে পাঁচটি প্রোটিন গ্রুপে ভাঁজ করা হয়, যা বিভিন্ন প্যাথোফিজিওলজিকাল প্রক্রিয়ার প্রতিনিধিত্ব করে। এডি মস্তিষ্কে সিন্যাপেস এবং মেটাবোলাইট হ্রাস পায়, কিন্তু সিএসএফ বৃদ্ধি পায়, যখন মস্তিষ্কে গ্লিয়াল-সমৃদ্ধ মাইলিনেশন এবং ইমিউন গ্রুপ এবং সিএসএফ বৃদ্ধি পায়। প্যানেল পরিবর্তনের সামঞ্জস্য এবং রোগের নির্দিষ্টতা 500 টিরও বেশি অতিরিক্ত CSF নমুনায় নিশ্চিত করা হয়েছিল। এই গোষ্ঠীগুলি অ্যাসিম্পটোমেটিক এডিতে জৈবিক উপগোষ্ঠীগুলিকেও চিহ্নিত করেছে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি AD-তে ক্লিনিকাল অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য ওয়েব-ভিত্তিক বায়োমার্কার সরঞ্জামগুলির দিকে একটি প্রতিশ্রুতিবদ্ধ পদক্ষেপ।
আল্জ্হেইমের রোগ (AD) হল বিশ্বব্যাপী নিউরোডিজেনারেটিভ ডিমেনশিয়ার সবচেয়ে সাধারণ কারণ এবং এটি সিন্যাপটিক ট্রান্সমিশন, গ্লিয়াল-মিডিয়াটেড ইমিউনিটি এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মেটাবলিজম (1-3) সহ বিস্তৃত জৈবিক সিস্টেমের কর্মহীনতার দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। যাইহোক, এর প্রতিষ্ঠিত প্রোটিন বায়োমার্কাররা এখনও অ্যামাইলয়েড এবং টাউ প্রোটিন সনাক্তকরণের উপর ফোকাস করে এবং তাই এই বৈচিত্র্যময় প্যাথোফিজিওলজি প্রতিফলিত করতে পারে না। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) এ সবচেয়ে নির্ভরযোগ্যভাবে পরিমাপ করা এই "কোর" প্রোটিন বায়োমার্কারগুলির মধ্যে রয়েছে (i) অ্যামাইলয়েড বিটা পেপটাইড 1-42 (Aβ1-42), যা কর্টিকাল অ্যামাইলয়েড প্লেকগুলির গঠনকে প্রতিফলিত করে; (ii) মোট টাউ, অ্যাক্সন অবক্ষয়ের একটি চিহ্ন; (iii) ফসফো-টাউ (পি-টাউ), প্যাথলজিক্যাল টাউ হাইপারফসফোরিলেশনের প্রতিনিধি (4-7)। যদিও এই সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড বায়োমার্কারগুলি আমাদের "চিহ্নিত" AD প্রোটিন রোগ (4-7) সনাক্তকরণকে ব্যাপকভাবে সহায়তা করেছে, তবে তারা এই রোগের পিছনে জটিল জীববিজ্ঞানের একটি ছোট অংশকে প্রতিনিধিত্ব করে।
AD বায়োমার্কারগুলির প্যাথোফিজিওলজিকাল বৈচিত্র্যের অভাব অনেক চ্যালেঞ্জের দিকে পরিচালিত করেছে, যার মধ্যে রয়েছে (i) AD রোগীদের জৈবিক বৈচিত্র্য সনাক্তকরণ এবং পরিমাপ করতে অক্ষমতা, (ii) রোগের তীব্রতা এবং অগ্রগতির অপর্যাপ্ত পরিমাপ, বিশেষত প্রাক-ক্লিনিকাল পর্যায়ে, এবং ( iii) থেরাপিউটিক ওষুধের বিকাশ যা স্নায়বিক অবনতির সমস্ত দিক সম্পূর্ণরূপে সমাধান করতে ব্যর্থ হয়েছে। সম্পর্কিত রোগ থেকে AD বর্ণনা করার জন্য ল্যান্ডমার্ক প্যাথলজির উপর আমাদের নির্ভরতা শুধুমাত্র এই সমস্যাগুলিকে বাড়িয়ে তোলে। আরও বেশি বেশি প্রমাণ দেখায় যে ডিমেনশিয়া আক্রান্ত বেশিরভাগ বয়স্ক ব্যক্তিদের জ্ঞানীয় পতনের একাধিক রোগগত বৈশিষ্ট্য রয়েছে (8)। AD প্যাথলজিতে আক্রান্ত 90% বা তার বেশি ব্যক্তিরও ভাস্কুলার ডিজিজ, TDP-43 ইনক্লুশন বা অন্যান্য অবক্ষয়জনিত রোগ (9) রয়েছে। প্যাথলজিকাল ওভারল্যাপের এই উচ্চ অনুপাত ডিমেনশিয়ার জন্য আমাদের বর্তমান ডায়গনিস্টিক কাঠামোকে ব্যাহত করেছে এবং রোগের আরও ব্যাপক প্যাথোফিজিওলজিকাল সংজ্ঞা প্রয়োজন।
বিভিন্ন ধরনের AD বায়োমার্কারের জরুরী প্রয়োজনের পরিপ্রেক্ষিতে, ক্ষেত্রটি বায়োমার্কারগুলি আবিষ্কার করার জন্য সামগ্রিক সিস্টেমের উপর ভিত্তি করে ক্রমবর্ধমানভাবে "ওমিক্স" পদ্ধতি গ্রহণ করছে। অ্যাক্সিলারেটেড ফার্মাসিউটিক্যাল পার্টনারশিপ (এএমপি)-এডি অ্যালায়েন্স 2014 সালে চালু করা হয়েছিল এবং প্রোগ্রামের অগ্রভাগে রয়েছে। ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ, একাডেমিয়া এবং শিল্পের এই বহুবিষয়ক প্রচেষ্টার লক্ষ্য হল AD এর প্যাথোফিজিওলজিকে আরও ভালভাবে সংজ্ঞায়িত করার জন্য সিস্টেম-ভিত্তিক কৌশলগুলি ব্যবহার করা এবং জীববৈচিত্র্য ডায়গনিস্টিক বিশ্লেষণ এবং চিকিত্সার কৌশলগুলি বিকাশ করা (10)। এই প্রকল্পের অংশ হিসাবে, নেটওয়ার্ক প্রোটিওমিক্স AD এ সিস্টেম-ভিত্তিক বায়োমার্কারগুলির অগ্রগতির জন্য একটি প্রতিশ্রুতিশীল হাতিয়ার হয়ে উঠেছে। এই নিরপেক্ষ ডেটা-চালিত পদ্ধতিটি জটিল প্রোটিওমিক্স ডেটা সেটগুলিকে সংগঠিত করে সম-প্রকাশিত প্রোটিনের "মডিউল" গোষ্ঠীতে যা নির্দিষ্ট কোষের ধরন, অর্গানেল এবং জৈবিক ফাংশনের সাথে যুক্ত (11-13)। প্রায় 12টি তথ্য-সমৃদ্ধ নেটওয়ার্ক প্রোটিওমিক্স অধ্যয়ন AD মস্তিষ্কের উপর পরিচালিত হয়েছে (13-23)। সামগ্রিকভাবে, এই বিশ্লেষণগুলি ইঙ্গিত দেয় যে এডি ব্রেন নেটওয়ার্ক প্রোটিওম স্বাধীন কোহর্ট এবং একাধিক কর্টিকাল অঞ্চলে একটি অত্যন্ত সংরক্ষিত মডুলার সংস্থা বজায় রাখে। উপরন্তু, এই মডিউলগুলির মধ্যে কয়েকটি ডেটা সেট জুড়ে AD- সম্পর্কিত প্রাচুর্যের পুনরুত্পাদনযোগ্য পরিবর্তনগুলি দেখায়, যা একাধিক রোগের প্যাথোফিজিওলজিকে প্রতিফলিত করে। সমষ্টিগতভাবে, এই ফলাফলগুলি AD-তে সিস্টেম-ভিত্তিক বায়োমার্কার হিসাবে মস্তিষ্কের নেটওয়ার্ক প্রোটিওম আবিষ্কারের জন্য একটি প্রতিশ্রুতিবদ্ধ অ্যাঙ্কর পয়েন্ট প্রদর্শন করে।
এডি ব্রেন নেটওয়ার্ক প্রোটিওমকে ক্লিনিক্যালি উপযোগী সিস্টেম-ভিত্তিক বায়োমার্কারে রূপান্তর করার জন্য, আমরা AD CSF-এর প্রোটোমিক বিশ্লেষণের সাথে মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্ত নেটওয়ার্ককে একত্রিত করেছি। এই সমন্বিত পদ্ধতির ফলে সিএসএফ বায়োমার্কারের পাঁচটি প্রতিশ্রুতিশীল সেট সনাক্ত করা হয়েছে যা মস্তিষ্ক-ভিত্তিক প্যাথোফিজিওলজির বিস্তৃত পরিসরের সাথে যুক্ত, যার মধ্যে রয়েছে সিন্যাপ্স, রক্তনালী, মেলিনেশন, প্রদাহ এবং বিপাকীয় পথের কর্মহীনতা। আমরা বিভিন্ন নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের 500 টিরও বেশি CSF নমুনা সহ একাধিক প্রতিলিপি বিশ্লেষণের মাধ্যমে এই বায়োমার্কার প্যানেলগুলিকে সফলভাবে যাচাই করেছি। এই বৈধতা বিশ্লেষণের মধ্যে রয়েছে উপসর্গবিহীন AD (AsymAD) রোগীদের CSF-এ গ্রুপ লক্ষ্য পরীক্ষা করা বা একটি সাধারণ জ্ঞানীয় পরিবেশে অস্বাভাবিক অ্যামাইলয়েড জমা হওয়ার প্রমাণ দেখানো। এই বিশ্লেষণগুলি AsymAD জনসংখ্যার উল্লেখযোগ্য জৈবিক বৈচিত্র্যকে হাইলাইট করে এবং প্যানেল মার্কারগুলি সনাক্ত করে যা রোগের প্রাথমিক পর্যায়ে ব্যক্তিদের উপ-টাইপ করতে সক্ষম হতে পারে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি একাধিক সিস্টেমের উপর ভিত্তি করে প্রোটিন বায়োমার্কার সরঞ্জামগুলির বিকাশের একটি মূল পদক্ষেপের প্রতিনিধিত্ব করে যা AD দ্বারা সম্মুখীন অনেক ক্লিনিকাল চ্যালেঞ্জ সফলভাবে সমাধান করতে পারে।
এই অধ্যয়নের মূল উদ্দেশ্য হল নতুন সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড বায়োমার্কার সনাক্ত করা যা বিভিন্ন মস্তিষ্ক-ভিত্তিক প্যাথোফিজিওলজিকে প্রতিফলিত করে যা AD এর দিকে পরিচালিত করে। চিত্র S1 আমাদের গবেষণা পদ্ধতির রূপরেখা দেয়, যার মধ্যে রয়েছে (i) একটি বিস্তৃত বিশ্লেষণ যা AD CSF এবং নেটওয়ার্ক ব্রেন প্রোটিওমের প্রাথমিক অনুসন্ধান দ্বারা চালিত একাধিক মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত CSF রোগের বায়োমার্কার সনাক্ত করতে এবং (ii) পরবর্তী প্রতিলিপি এই বায়োমার্কারগুলি বেশ কয়েকটি স্বাধীন সেরিব্রোস্পাইনালের মধ্যে রয়েছে। তরল সমগোত্রীয় আবিষ্কার-ভিত্তিক গবেষণাটি এমরি গোইজুয়েটা আলঝেইমার ডিজিজ রিসার্চ সেন্টারে (ADRC) 20 জন জ্ঞানগতভাবে স্বাভাবিক ব্যক্তি এবং 20 AD রোগীর মধ্যে CSF-এর ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণের মাধ্যমে শুরু হয়েছিল। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে কম Aβ1-42 এবং মোট টাউ এবং পি-টাউ-এর উচ্চ স্তরের উপস্থিতিতে AD এর নির্ণয় একটি উল্লেখযোগ্য জ্ঞানীয় দুর্বলতা হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয় [মান মন্ট্রিল কগনিটিভ অ্যাসেসমেন্ট (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (সারণী S1A)। নিয়ন্ত্রণে (মানে MoCA, 26.7 ± 2.2) CSF বায়োমার্কারের স্বাভাবিক মাত্রা ছিল।
মানব CSF প্রোটিনের প্রাচুর্যের একটি গতিশীল পরিসর দ্বারা চিহ্নিত করা হয়, যেখানে অ্যালবুমিন এবং অন্যান্য অত্যন্ত প্রচুর প্রোটিন আগ্রহের প্রোটিন সনাক্তকরণ প্রতিরোধ করতে পারে (24)। প্রোটিন আবিষ্কারের গভীরতা বাড়ানোর জন্য, আমরা ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস) বিশ্লেষণ (24) এর আগে প্রতিটি CSF নমুনা থেকে প্রথম 14টি প্রচুর পরিমাণে প্রোটিন সরিয়ে দিয়েছি। এমএস দ্বারা মোট 39,805টি পেপটাইড সনাক্ত করা হয়েছিল, যা 40টি নমুনায় 3691টি প্রোটিওমে ম্যাপ করা হয়েছিল। প্রোটিন পরিমাণ নির্ধারণ মাল্টিপল টেন্ডেম মাস ট্যাগ (টিএমটি) লেবেলিং (18, 25) দ্বারা সঞ্চালিত হয়। অনুপস্থিত ডেটা সমাধান করার জন্য, আমরা কেবলমাত্র সেই প্রোটিনগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করেছি যা পরবর্তী বিশ্লেষণে কমপক্ষে 50% নমুনাগুলিতে পরিমাপ করা হয়েছিল, এইভাবে অবশেষে 2875 প্রোটিওমের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। মোট প্রোটিন প্রাচুর্যের মাত্রার মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্যের কারণে, একটি নিয়ন্ত্রণ নমুনা পরিসংখ্যানগতভাবে একটি বহিরাগত (13) হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল এবং পরবর্তী বিশ্লেষণে অন্তর্ভুক্ত করা হয়নি। অবশিষ্ট 39টি নমুনার প্রাচুর্যের মানগুলি বয়স, লিঙ্গ এবং ব্যাচ সহভঙ্গি অনুসারে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল (13-15, 17, 18, 20, 26)।
রিগ্রেশন ডেটা সেটে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করার জন্য পরিসংখ্যানগত টি-পরীক্ষা বিশ্লেষণ ব্যবহার করে, এই বিশ্লেষণটি প্রোটিন চিহ্নিত করেছে যার প্রাচুর্যের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছে (P <0.05) নিয়ন্ত্রণ এবং AD ক্ষেত্রে (টেবিল S2A)। চিত্র 1A-তে দেখানো হয়েছে, AD তে মোট 225টি প্রোটিনের প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং 303টি প্রোটিনের প্রাচুর্য উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। এই ভিন্নভাবে প্রকাশ করা প্রোটিনের মধ্যে রয়েছে পূর্বে চিহ্নিত সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড AD মার্কার, যেমন মাইক্রোটিউবুল-সম্পর্কিত প্রোটিন টাউ (MAPT; P = 3.52 × 10−8), নিউরোফিলামেন্ট (NEFL; P = 6.56 × 10−3), বৃদ্ধি-সম্পর্কিত প্রোটিন 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), ফ্যাটি অ্যাসিড বাইন্ডিং প্রোটিন 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 লাইক 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), নিউরাল গ্রানুলিন (NRGN; P = 3.43 × 10−4) এবং VGF স্নায়ু বৃদ্ধির ফ্যাক্টর (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6)। যাইহোক, আমরা অন্যান্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ লক্ষ্যগুলিও চিহ্নিত করেছি, যেমন জিডিপি ডিসোসিয়েশন ইনহিবিটর 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) এবং SPARC-সম্পর্কিত মডুলার ক্যালসিয়াম বাইন্ডিং 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9)। জিন অন্টোলজি (জিও) 225টি উল্লেখযোগ্যভাবে কমে যাওয়া প্রোটিনের বিশ্লেষণে শরীরের তরল প্রক্রিয়া যেমন স্টেরয়েড বিপাক, রক্ত ​​জমাট বাঁধা এবং হরমোন কার্যকলাপের সাথে ঘনিষ্ঠ সংযোগ প্রকাশ করেছে (চিত্র 1B এবং টেবিল S2B)। বিপরীতে, 303 এর উল্লেখযোগ্যভাবে বর্ধিত প্রোটিন কোষের গঠন এবং শক্তি বিপাকের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত।
(A) আগ্নেয়গিরির প্লট টি-পরীক্ষা দ্বারা প্রাপ্ত -log10 পরিসংখ্যানগত P মান (y-অক্ষ) এর সাপেক্ষে লগ2 ভাঁজ পরিবর্তন (x-অক্ষ) দেখায়, যা নিয়ন্ত্রণ (CT) এবং এর মধ্যে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয় সমস্ত প্রোটিনের মধ্যে CSF প্রোটিওমের AD কেস। AD তে উল্লেখযোগ্যভাবে কমে যাওয়া স্তরের (P <0.05) প্রোটিনগুলিকে নীল রঙে দেখানো হয়েছে, যেখানে রোগের উল্লেখযোগ্য মাত্রায় বেড়ে যাওয়া প্রোটিনগুলিকে লাল রঙে দেখানো হয়েছে৷ নির্বাচিত প্রোটিন লেবেল করা হয়। (বি) প্রোটিন সম্পর্কিত শীর্ষ GO পদগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস (নীল) এবং AD-তে বৃদ্ধি (লাল)। জৈবিক প্রক্রিয়া, আণবিক ফাংশন এবং সেলুলার উপাদানগুলির ক্ষেত্রে সর্বোচ্চ জেড-স্কোর সহ তিনটি GO পদ দেখায়। (C) CSF নমুনায় MS পরিমাপিত MAPT স্তর (বাম) এবং নমুনা ELISA টাউ স্তরের (ডানদিকে) সাথে এর পারস্পরিক সম্পর্ক। প্রাসঙ্গিক P মানের সাথে পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ প্রদর্শিত হয়। একটি AD কেসের জন্য ELISA ডেটার অভাবের কারণে, এই পরিসংখ্যানগুলি 39টি বিশ্লেষণ করা ক্ষেত্রে 38টির মান অন্তর্ভুক্ত করে। (D) তত্ত্বাবধানে ক্লাস্টার বিশ্লেষণ (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) সামঞ্জস্য করা P <0.01) নিয়ন্ত্রণে এবং AD CSF ডেটা সেটে 65টি সবচেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিন ব্যবহার করে নমুনা খুঁজে পেয়েছে। প্রমিতকরণ, স্বাভাবিককরণ।
MAPT-এর প্রোটোমিক স্তরটি স্বাধীনভাবে পরিমাপ করা ELISA টাউ স্তরের (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; চিত্র 1C) সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত, যা আমাদের MS পরিমাপের বৈধতা সমর্থন করে৷ অ্যামাইলয়েড প্রিকার্সর প্রোটিন (এপিপি) স্তরে ট্রিপসিন হজমের পরে, Aβ1-40 এবং Aβ1-42 এর সি-টার্মিনাসে ম্যাপ করা আইসোফর্ম-নির্দিষ্ট পেপটাইডগুলি দক্ষতার সাথে আয়নিত করা যায় না (27, 28)। অতএব, আমরা শনাক্ত করা APP পেপটাইডগুলির সাথে ELISA Aβ1-42 স্তরের কোনও সম্পর্ক নেই। প্রতিটি ক্ষেত্রে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা নমুনাগুলির (টেবিল S2A) তত্ত্বাবধানে ক্লাস্টার বিশ্লেষণ করতে P <0.0001 [মিথ্যা আবিষ্কারের হার (FDR) সংশোধন করা P <0.01] সহ ভিন্নভাবে প্রকাশ করা প্রোটিন ব্যবহার করেছি। চিত্র 1D তে দেখানো হয়েছে, এই 65টি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ প্রোটিন রোগের অবস্থা অনুযায়ী সঠিকভাবে ক্লাস্টার নমুনা করতে পারে, একটি AD ক্ষেত্রে নিয়ন্ত্রণের মতো বৈশিষ্ট্যগুলি ছাড়া। এই 65টি প্রোটিনের মধ্যে 63টি খ্রিস্টাব্দে বেড়েছে, যেখানে মাত্র দুটি (CD74 এবং ISLR) কমেছে। মোট, এই সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড বিশ্লেষণগুলি AD-তে শত শত প্রোটিন সনাক্ত করেছে যা রোগের বায়োমার্কার হিসাবে কাজ করতে পারে।
তারপরে আমরা AD মস্তিষ্কের প্রোটিওমের একটি স্বাধীন নেটওয়ার্ক বিশ্লেষণ করেছি। এই আবিষ্কারের মস্তিষ্কের গোষ্ঠীর মধ্যে রয়েছে নিয়ন্ত্রণ থেকে ডোরসোলেটারাল প্রিফ্রন্টাল কর্টেক্স (ডিএলপিএফসি), পারকিনসন্স ডিজিজ (পিডি; এন = 10), মিশ্র AD/PD (n = 10) এবং AD (n = 10) ক্ষেত্রে। ) নমুনা। Emery Goizueta ADRC. এই 40টি ক্ষেত্রের জনসংখ্যা পূর্বে বর্ণনা করা হয়েছে (25) এবং সারণী S1B-তে সংক্ষিপ্ত করা হয়েছে। আমরা এই 40 টি মস্তিষ্কের টিস্যু এবং 27 টি ক্ষেত্রে প্রতিলিপি দল বিশ্লেষণ করতে TMT-MS ব্যবহার করেছি। মোট, এই দুটি মস্তিষ্কের ডেটা সেট 227,121টি অনন্য পেপটাইড তৈরি করেছে, যা 12,943 প্রোটিওমে (25) ম্যাপ করা হয়েছিল। কেবলমাত্র সেই প্রোটিনগুলি যা কমপক্ষে 50% ক্ষেত্রে পরিমাপ করা হয়েছিল পরবর্তী তদন্তগুলিতে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। চূড়ান্ত আবিষ্কারের ডেটা সেটটিতে 8817টি পরিমাণযুক্ত প্রোটিন রয়েছে। বয়স, লিঙ্গ এবং পোস্ট-মর্টেম ইন্টারভাল (PMI) এর উপর ভিত্তি করে প্রোটিনের প্রাচুর্যের মাত্রা সামঞ্জস্য করুন। রিগ্রেশনের পরে সেট করা ডেটার ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে 2000 প্রোটিনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছে [P <0.05, ভ্যারিয়েন্সের বিশ্লেষণ (ANOVA)] দুই বা ততোধিক রোগের দলে। তারপরে, আমরা আলাদাভাবে প্রকাশিত প্রোটিনের উপর ভিত্তি করে একটি তত্ত্বাবধানে ক্লাস্টার বিশ্লেষণ করেছি এবং AD/নিয়ন্ত্রণ এবং/অথবা AD/PD তুলনাতে P <0.0001 (চিত্র S2, A এবং B, টেবিল S2C)। এই 165টি অত্যন্ত পরিবর্তিত প্রোটিন স্পষ্টভাবে নিয়ন্ত্রণ এবং PD নমুনা থেকে AD প্যাথলজি সহ কেসগুলিকে চিত্রিত করে, পুরো প্রোটিওমে শক্তিশালী AD-নির্দিষ্ট পরিবর্তনগুলি নিশ্চিত করে।
আমরা তখন আবিষ্কৃত মস্তিষ্কের প্রোটিওমে নেটওয়ার্ক বিশ্লেষণ করতে ওয়েটেড জিন কো-এক্সপ্রেশন নেটওয়ার্ক অ্যানালাইসিস (WGCNA) নামে একটি অ্যালগরিদম ব্যবহার করেছি, যা একই রকম এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন (11-13) সহ প্রোটিন মডিউলগুলিতে ডেটা সেট সংগঠিত করে। বিশ্লেষণে 44টি মডিউল (M) সহ-প্রকাশিত প্রোটিন চিহ্নিত করা হয়েছে, সবচেয়ে বড় (M1, n = 1821 প্রোটিন) থেকে ক্ষুদ্রতম (M44, n = 34 প্রোটিন) (চিত্র 2A এবং টেবিল S2D) পর্যন্ত সাজানো এবং সংখ্যা করা হয়েছে। উপরে উল্লিখিত হিসাবে (13) প্রতিটি মডিউলের প্রতিনিধি অভিব্যক্তি প্রোফাইল বা বৈশিষ্ট্যযুক্ত প্রোটিন গণনা করুন, এবং এটি রোগের অবস্থা এবং AD প্যাথলজির সাথে সম্পর্কযুক্ত করুন, অর্থাৎ, আলঝাইমার ডিজিজ রেজিস্ট্রি (CERAD) এবং Braak স্কোর (চিত্র 2B) এর জোট স্থাপন করুন। সামগ্রিকভাবে, 17 টি মডিউল উল্লেখযোগ্যভাবে AD নিউরোপ্যাথলজি (P <0.05) এর সাথে সম্পর্কিত ছিল। এই রোগ-সম্পর্কিত মডিউলগুলির মধ্যে অনেকগুলি কোষের প্রকার-নির্দিষ্ট মার্কারগুলিতেও সমৃদ্ধ (চিত্র 2B)। উপরে উল্লিখিত (13), কোষের প্রকার সমৃদ্ধকরণ মডিউল ওভারল্যাপ এবং কোষের প্রকার-নির্দিষ্ট জিনের রেফারেন্স তালিকা বিশ্লেষণ করে নির্ধারিত হয়। এই জিনগুলি বিচ্ছিন্ন মাউস নিউরন, এন্ডোথেলিয়াল এবং গ্লিয়াল কোষে প্রকাশিত ডেটা থেকে প্রাপ্ত। RNA সিকোয়েন্সিং (RNA-seq) পরীক্ষা (29)।
(A) মস্তিষ্কের প্রোটিওমের WGCNA আবিষ্কার করুন। (B) CERAD (Aβ ফলক) এবং Braak (tau tangles) স্কোর সহ AD নিউরোপ্যাথলজিকাল বৈশিষ্ট্য (শীর্ষ) সহ মডুলার সিগনেচার প্রোটিন (মডুলার প্রোটিন এক্সপ্রেশনের প্রথম প্রধান উপাদান) এর বাইওয়েট মিডকোরিলেশন (BiCor) বিশ্লেষণ। ইতিবাচক (লাল) এবং নেতিবাচক (নীল) পারস্পরিক সম্পর্কের তীব্রতা একটি দুই রঙের তাপ মানচিত্র দ্বারা দেখানো হয়, এবং তারকাচিহ্নগুলি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য নির্দেশ করে (P <0.05)। প্রতিটি প্রোটিন মডিউলের সেল টাইপ অ্যাসোসিয়েশন মূল্যায়ন করতে হাইপারজিওমেট্রিক ফিশারস এক্স্যাক্ট টেস্ট (এফইটি) (নীচে) ব্যবহার করুন। লাল ছায়ার তীব্রতা কোষের প্রকার সমৃদ্ধকরণের ডিগ্রি নির্দেশ করে এবং তারকাচিহ্ন পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য নির্দেশ করে (P <0.05)। FET থেকে প্রাপ্ত P মান সংশোধন করতে BH পদ্ধতি ব্যবহার করুন। (C) মডুলার প্রোটিনের GO বিশ্লেষণ। প্রতিটি মডিউল বা সম্পর্কিত মডিউল গ্রুপের জন্য সবচেয়ে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত জৈবিক প্রক্রিয়াগুলি দেখানো হয়। oligo, oligodendrocyte.
পাঁচটি ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত অ্যাস্ট্রোসাইট এবং মাইক্রোগ্লিয়া-সমৃদ্ধ মডিউলের একটি সেট (M30, M29, M18, M24, এবং M5) AD নিউরোপ্যাথোলজি (চিত্র 2B) এর সাথে একটি শক্তিশালী ইতিবাচক সম্পর্ক দেখিয়েছে। অন্টোলজি বিশ্লেষণ এই গ্লিয়াল মডিউলগুলিকে কোষের বৃদ্ধি, বিস্তার, এবং অনাক্রম্যতা (চিত্র 2C এবং টেবিল S2E) এর সাথে সংযুক্ত করে। দুটি অতিরিক্ত গ্লিয়াল মডিউল, এম 8 এবং এম 22, এছাড়াও রোগে দৃঢ়ভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়। M8 অত্যন্ত টোল-সদৃশ রিসেপ্টর পাথওয়ের সাথে সম্পর্কিত, একটি সংকেত ক্যাসকেড যা সহজাত ইমিউন প্রতিক্রিয়াতে একটি মুখ্য ভূমিকা পালন করে (30)। একই সময়ে, M22 পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তনের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। এম 2, যা অলিগোডেনড্রোসাইট সমৃদ্ধ, AD প্যাথলজির সাথে একটি শক্তিশালী ইতিবাচক সম্পর্ক এবং নিউক্লিওসাইড সংশ্লেষণ এবং ডিএনএ প্রতিলিপির সাথে একটি অন্টোলজিকাল সংযোগ দেখায়, যা রোগে বর্ধিত কোষের বিস্তারকে নির্দেশ করে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি গ্লিয়াল মডিউলগুলির উচ্চতাকে সমর্থন করে যা আমরা পূর্বে AD নেটওয়ার্ক প্রোটিওমে (13, 17) লক্ষ্য করেছি। বর্তমানে এটি পাওয়া গেছে যে নেটওয়ার্কে অনেক AD-সম্পর্কিত গ্লিয়াল মডিউল নিয়ন্ত্রণ এবং PD ক্ষেত্রে নিম্ন অভিব্যক্তি স্তর দেখায়, তাদের রোগের নির্দিষ্টতা হাইলাইট করে যা AD (চিত্র S2C) এ উন্নত।
আমাদের নেটওয়ার্ক প্রোটিওমের মাত্র চারটি মডিউল (M1, M3, M10, এবং M32) AD প্যাথলজি (P <0.05) (চিত্র 2, B এবং C) এর সাথে দৃঢ়ভাবে নেতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত। M1 এবং M3 উভয়ই নিউরোনাল মার্কার সমৃদ্ধ। M1 অত্যন্ত সিনাপটিক সংকেতের সাথে সম্পর্কিত, যখন M3 মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশনের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। M10 এবং M32 এর জন্য সেল টাইপ সমৃদ্ধির কোন প্রমাণ নেই। M32 M3 এবং কোষ বিপাকের মধ্যে সংযোগ প্রতিফলিত করে, যখন M10 অত্যন্ত কোষের বৃদ্ধি এবং মাইক্রোটিউবুল ফাংশনের সাথে সম্পর্কিত। AD এর সাথে তুলনা করে, সমস্ত চারটি মডিউল নিয়ন্ত্রণ এবং পিডিতে বৃদ্ধি পায়, তাদের রোগ-নির্দিষ্ট AD পরিবর্তন (চিত্র S2C) দেয়। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি নিউরন-সমৃদ্ধ মডিউলগুলির হ্রাস প্রাচুর্যকে সমর্থন করে যা আমরা পূর্বে AD (13, 17) এ পর্যবেক্ষণ করেছি। সংক্ষেপে, মস্তিষ্কের প্রোটিওমের নেটওয়ার্ক বিশ্লেষণ যা আমরা আবিষ্কার করেছি তা আমাদের পূর্ববর্তী অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ AD-বিশেষভাবে পরিবর্তিত মডিউল তৈরি করেছে।
AD একটি প্রাথমিক অ্যাসিম্পটোমেটিক স্টেজ (AsymAD) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়, যেখানে ব্যক্তিরা ক্লিনিকাল জ্ঞানীয় পতন ছাড়াই অ্যামাইলয়েড জমা প্রদর্শন করে (5, 31)। এই উপসর্গহীন পর্যায়টি প্রাথমিক সনাক্তকরণ এবং হস্তক্ষেপের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ উইন্ডো উপস্থাপন করে। আমরা পূর্বে স্বাধীন ডেটা সেট (13, 17) জুড়ে AsymAD এবং AD ব্রেন নেটওয়ার্ক প্রোটিওমের শক্তিশালী মডুলার সংরক্ষণ প্রদর্শন করেছি। আমরা বর্তমানে আবিষ্কৃত মস্তিষ্কের নেটওয়ার্ক এই পূর্ববর্তী ফলাফলগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা 27টি DLPFC সংস্থার প্রতিলিপিকৃত ডেটা সেটে 44টি মডিউল সংরক্ষণ বিশ্লেষণ করেছি। এই সংস্থাগুলির মধ্যে নিয়ন্ত্রণ (n = 10), AsymAD (n = 8 ) এবং AD (n = 9) কেস অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। কন্ট্রোল এবং এডি নমুনাগুলি আমাদের আবিষ্কার ব্রেন কোহর্ট (টেবিল এস 1 বি) এর বিশ্লেষণে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল, যখন অ্যাসিমএডি কেসগুলি কেবল প্রতিলিপি দলে অনন্য ছিল। এই AsymAD কেসগুলিও Emory Goizueta ADRC ব্রেন ব্যাঙ্ক থেকে এসেছে। যদিও মৃত্যুর সময় জ্ঞান স্বাভাবিক ছিল, অ্যামাইলয়েডের মাত্রা অস্বাভাবিকভাবে বেশি ছিল (মানে CERAD, 2.8 ± 0.5) (টেবিল S1B)।
এই 27 টি মস্তিষ্কের টিস্যুগুলির TMT-MS বিশ্লেষণের ফলে 11,244 প্রোটিওমের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছে। এই চূড়ান্ত গণনায় কেবলমাত্র সেই প্রোটিনগুলি অন্তর্ভুক্ত রয়েছে যা নমুনার কমপক্ষে 50% পরিমাণে পরিমাপ করা হয়েছে। এই প্রতিলিপিকৃত ডেটা সেটটিতে আমাদের আবিষ্কার মস্তিষ্কের বিশ্লেষণে সনাক্ত করা 8817 প্রোটিনের মধ্যে 8638 (98.0%) রয়েছে এবং নিয়ন্ত্রণ এবং AD সমগোত্রের মধ্যে প্রায় 3000টি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিন রয়েছে (P <0.05, প্রকরণ বিশ্লেষণের জন্য Tukey-এর পেয়ার করা টি পরীক্ষার পরে) ( টেবিল S2F)। এই ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিনগুলির মধ্যে, 910 এছাড়াও AD এবং মস্তিষ্কের প্রোটিওম কন্ট্রোল কেসগুলির মধ্যে উল্লেখযোগ্য স্তরের পরিবর্তন দেখায় (পি <0.05, ANOVA Tukey পেয়ারড টি-টেস্টের পরে)। এটি লক্ষণীয় যে এই 910 মার্কারগুলি প্রোটিওমের মধ্যে পরিবর্তনের দিক থেকে অত্যন্ত সামঞ্জস্যপূর্ণ (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (চিত্র S3A)। বর্ধিত প্রোটিনগুলির মধ্যে, ডেটা সেটগুলির মধ্যে সর্বাধিক সামঞ্জস্যপূর্ণ পরিবর্তন সহ প্রোটিনগুলি প্রধানত গ্লিয়াল-সমৃদ্ধ M5 এবং M18 মডিউলগুলির (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, এবং GFAP) সদস্য। হ্রাসকৃত প্রোটিনগুলির মধ্যে, সবচেয়ে সামঞ্জস্যপূর্ণ পরিবর্তনগুলি প্রায় একচেটিয়াভাবে M1 মডিউলের সদস্য (NPTX2, VGF, এবং RPH3A) সিন্যাপসের সাথে যুক্ত। আমরা ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (চিত্র S3B) দ্বারা মিডকাইন (MDK), CD44, সিক্রেটেড ফ্রিজড-সম্পর্কিত প্রোটিন 1 (SFRP1) এবং VGF-এর AD-সম্পর্কিত পরিবর্তনগুলি আরও যাচাই করেছি। মডিউল সংরক্ষণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে মস্তিষ্কের প্রোটিওমের প্রায় 80% প্রোটিন মডিউল (34/44) প্রতিলিপি ডেটা সেটে উল্লেখযোগ্যভাবে সংরক্ষিত ছিল (z-স্কোর> 1.96, FDR সংশোধন করা P <0.05) (চিত্র S3C)। এই মডিউলগুলির মধ্যে চৌদ্দটি বিশেষভাবে দুটি প্রোটিওমের মধ্যে সংরক্ষিত ছিল (z-স্কোর> 10, FDR সংশোধন করা P <1.0 × 10−23)। সামগ্রিকভাবে, মস্তিষ্কের প্রোটিওমের মধ্যে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন এবং মডুলার কম্পোজিশনে উচ্চ মাত্রার সামঞ্জস্যের আবিষ্কার এবং প্রতিলিপি এডি ফ্রন্টাল কর্টেক্স প্রোটিনের পরিবর্তনের প্রজননযোগ্যতাকে হাইলাইট করে। উপরন্তু, এটি নিশ্চিত করেছে যে AsymAD এবং আরও উন্নত রোগগুলির একটি খুব অনুরূপ মস্তিষ্কের নেটওয়ার্ক গঠন রয়েছে।
মস্তিষ্কের প্রতিলিপি ডেটা সেটে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশনের আরও বিশদ বিশ্লেষণ AsymAD প্রোটিন পরিবর্তনের উল্লেখযোগ্য ডিগ্রি হাইলাইট করে, যার মধ্যে AsymAD এবং নিয়ন্ত্রণ (P <0.05) (চিত্র S3D) এর মধ্যে মোট 151টি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত প্রোটিন রয়েছে। অ্যামাইলয়েড লোডের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, AsymAD এবং AD এর মস্তিষ্কে APP উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। MAPT শুধুমাত্র AD-তে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়, যা জট বৃদ্ধির মাত্রার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং জ্ঞানীয় পতনের সাথে এর পরিচিত পারস্পরিক সম্পর্ক (5, 7)। গ্লিয়াল-সমৃদ্ধ মডিউলগুলি (M5 এবং M18) AsymAD-এ বর্ধিত প্রোটিনে অত্যন্ত প্রতিফলিত হয়, যখন নিউরন-সম্পর্কিত M1 মডিউল AsymAD-এর হ্রাসকৃত প্রোটিনের সবচেয়ে প্রতিনিধি। এই AsymAD মার্কারগুলির মধ্যে অনেকগুলি লক্ষণীয় রোগে বৃহত্তর পরিবর্তন দেখায়। এই মার্কারগুলির মধ্যে SMOC1, M18 এর অন্তর্গত একটি গ্লিয়াল প্রোটিন, যা মস্তিষ্কের টিউমার এবং চোখ ও অঙ্গ-প্রত্যঙ্গের বিকাশের সাথে যুক্ত (32)। MDK হল কোষের বৃদ্ধি এবং এনজিওজেনেসিস (33) এর সাথে সম্পর্কিত একটি হেপারিন-বাইন্ডিং বৃদ্ধির ফ্যাক্টর, M18 এর আরেকটি সদস্য। কন্ট্রোল গ্রুপের সাথে তুলনা করে, AsymAD উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, এর পরে AD-তে আরও বৃদ্ধি পেয়েছে। বিপরীতে, সিনাপটিক প্রোটিন নিউরোপেনট্রাক্সিন 2 (NPTX2) AsymAD মস্তিষ্কে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। এনপিটিএক্স 2 পূর্বে নিউরোডিজেনারেশনের সাথে যুক্ত ছিল এবং উত্তেজক সিন্যাপসেস (34) মধ্যস্থতায় একটি স্বীকৃত ভূমিকা রয়েছে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি AD-তে বিভিন্ন প্রিক্লিনিকাল প্রোটিন পরিবর্তনগুলি প্রকাশ করে যা রোগের তীব্রতার সাথে অগ্রগতি বলে মনে হয়।
প্রদত্ত যে আমরা মস্তিষ্কের প্রোটিওম আবিষ্কারে প্রোটিন কভারেজের একটি উল্লেখযোগ্য গভীরতা অর্জন করেছি, আমরা নেটওয়ার্ক-স্তরের AD ট্রান্সক্রিপ্টোমের সাথে এর ওভারল্যাপটি আরও সম্পূর্ণরূপে বোঝার চেষ্টা করছি। অতএব, আমরা AD (n = 308) এবং কন্ট্রোল (n = 157) DLPFC টিস্যু (13) এ 18,204 জিনের মাইক্রোয়ারে পরিমাপ থেকে আমরা পূর্বে যে মডিউলটি আবিষ্কার করেছি তার সাথে আমরা আবিষ্কার করেছি মস্তিষ্কের প্রোটিওমের তুলনা করেছি। ওভারল্যাপিং মোট, আমরা 20 টি ভিন্ন আরএনএ মডিউল সনাক্ত করেছি, যার মধ্যে অনেকগুলি নিউরন, অলিগোডেনড্রোসাইটস, অ্যাস্ট্রোসাইটস এবং মাইক্রোগ্লিয়া (চিত্র 3A) সহ নির্দিষ্ট কোষের ধরণের সমৃদ্ধি প্রদর্শন করেছে। AD-তে এই মডিউলগুলির একাধিক পরিবর্তন চিত্র 3B-তে দেখানো হয়েছে। গভীর লেবেলবিহীন এমএস প্রোটিওম (প্রায় 3000টি প্রোটিন) (13) ব্যবহার করে আমাদের পূর্ববর্তী প্রোটিন-আরএনএ ওভারল্যাপ বিশ্লেষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, মস্তিষ্কের প্রোটিওম নেটওয়ার্কের 44টি মডিউলের বেশিরভাগই ট্রান্সক্রিপ্টোম নেটওয়ার্কের মধ্যে রয়েছে। আমাদের আবিষ্কার এবং 34টি প্রোটিন মডিউলের প্রতিলিপি যা মস্তিষ্কের প্রোটিওমে অত্যন্ত ধরে রাখা হয়েছে, শুধুমাত্র 14 (~40%) ফিশারের সঠিক পরীক্ষায় (FET) পাস করেছে ট্রান্সক্রিপ্টোমের সাথে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপ (চিত্র 3A)। DNA ক্ষতি মেরামত (P-M25 এবং P-M19), প্রোটিন অনুবাদ (P-M7 এবং P-M20), RNA বাইন্ডিং/স্প্লিসিং (P-M16 এবং P-M21) এবং প্রোটিন টার্গেটিং (P-M13 এবং P-) এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। M23) ট্রান্সক্রিপ্টোমে মডিউলগুলির সাথে ওভারল্যাপ করে না। অতএব, যদিও বর্তমান ওভারল্যাপ বিশ্লেষণে (13) একটি গভীর প্রোটিওম ডেটা সেট ব্যবহার করা হয়, তবে বেশিরভাগ AD নেটওয়ার্ক প্রোটিওম ট্রান্সক্রিপ্টোম নেটওয়ার্কে ম্যাপ করা হয় না।
(A) হাইপারজিওমেট্রিক FET AD ট্রান্সক্রিপ্টোমের RNA মডিউলে (শীর্ষ) কোষের ধরন-নির্দিষ্ট মার্কারগুলির সমৃদ্ধি এবং AD মস্তিষ্কের RNA (x-অক্ষ) এবং প্রোটিন (y-অক্ষ) মডিউলগুলির মধ্যে ওভারল্যাপের ডিগ্রি প্রদর্শন করে। (নীচে)। লাল শেডিংয়ের তীব্রতা উপরের প্যানেলে কোষের প্রকারের সমৃদ্ধির ডিগ্রি এবং নীচের প্যানেলে মডিউলগুলির ওভারল্যাপের তীব্রতা নির্দেশ করে। তারকাচিহ্নগুলি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য নির্দেশ করে (P <0.05)। (B) প্রতিটি ট্রান্সক্রিপ্টোম মডিউল এবং AD অবস্থার বৈশিষ্ট্যগত জিনের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্কের ডিগ্রি। বাম দিকের মডিউলগুলি AD (নীল) এর সাথে সবচেয়ে নেতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত এবং ডানদিকেরগুলি AD (লাল) এর সাথে সবচেয়ে ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত। লগ-রূপান্তরিত BH-সংশোধিত P মান প্রতিটি পারস্পরিক সম্পর্কের পরিসংখ্যানগত তাত্পর্যের মাত্রা নির্দেশ করে। (C) শেয়ার্ড সেল টাইপ সমৃদ্ধি সহ উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপিং মডিউল। (D) ওভারল্যাপিং মডিউলে লেবেলযুক্ত প্রোটিন (x-অক্ষ) এবং RNA (y-অক্ষ) এর log2 ভাঁজ পরিবর্তনের পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ। প্রাসঙ্গিক P মানের সাথে পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ প্রদর্শিত হয়। মাইক্রো, মাইক্রোগ্লিয়া; মহাকাশীয় দেহ, অ্যাস্ট্রোসাইট। সিটি, নিয়ন্ত্রণ।
বেশিরভাগ ওভারল্যাপিং প্রোটিন এবং আরএনএ মডিউল একই ধরনের কোষের সমৃদ্ধকরণ প্রোফাইল এবং সামঞ্জস্যপূর্ণ AD পরিবর্তনের দিকনির্দেশ (চিত্র 3, B এবং C) ভাগ করে। অন্য কথায়, মস্তিষ্কের প্রোটিওম (PM​1) এর সিন্যাপস-সম্পর্কিত M1 মডিউলটি তিনটি নিউরোনাল-সমৃদ্ধ হোমোলোগাস আরএনএ মডিউল (R-M1, R-M9 এবং R-M16) এর সাথে ম্যাপ করা হয়েছে, যা AD উভয়েই দেখানো হয়েছে। একটি হ্রাস স্তর। একইভাবে, গ্লিয়াল-সমৃদ্ধ M5 এবং M18 প্রোটিন মডিউলগুলি অ্যাস্ট্রোসাইট এবং মাইক্রোগ্লিয়াল মার্কার (R-M3, R-M7, এবং R-M10) সমৃদ্ধ RNA মডিউলগুলির সাথে ওভারল্যাপ করে এবং রোগ বৃদ্ধিতে অত্যন্ত জড়িত। দুটি ডেটা সেটের মধ্যে এই ভাগ করা মডুলার বৈশিষ্ট্যগুলি কোষের প্রকার সমৃদ্ধকরণ এবং রোগ-সম্পর্কিত পরিবর্তনগুলিকে আরও সমর্থন করে যা আমরা মস্তিষ্কের প্রোটিওমে লক্ষ্য করেছি। যাইহোক, আমরা এই ভাগ করা মডিউলগুলিতে পৃথক মার্কারগুলির আরএনএ এবং প্রোটিন স্তরের মধ্যে অনেকগুলি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য লক্ষ্য করেছি। এই ওভারল্যাপিং মডিউল (চিত্র 3D) এর মধ্যে অণুর প্রোটিওমিক্স এবং ট্রান্সক্রিপ্টমিক্সের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশনের পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ এই অসঙ্গতিকে হাইলাইট করে। উদাহরণস্বরূপ, APP এবং অন্যান্য বেশ কয়েকটি গ্লিয়াল মডিউল প্রোটিন (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, এবং SFRP1) AD প্রোটিওমে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি দেখিয়েছে, কিন্তু AD ট্রান্সক্রিপ্টোমে প্রায় কোনও পরিবর্তন হয়নি। এই প্রোটিন-নির্দিষ্ট পরিবর্তনগুলি অ্যামাইলয়েড প্লেকগুলির সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত হতে পারে (23, 35), প্যাথলজিকাল পরিবর্তনের উত্স হিসাবে প্রোটিওমকে হাইলাইট করে এবং এই পরিবর্তনগুলি ট্রান্সক্রিপ্টোমে প্রতিফলিত নাও হতে পারে।
আমরা আবিষ্কার করেছি মস্তিষ্ক এবং CSF প্রোটিওমগুলি স্বাধীনভাবে বিশ্লেষণ করার পরে, আমরা মস্তিষ্কের নেটওয়ার্কের প্যাথোফিজিওলজি সম্পর্কিত AD CSF বায়োমার্কার সনাক্ত করতে দুটি ডেটা সেটের একটি ব্যাপক বিশ্লেষণ পরিচালনা করেছি। আমাদের প্রথমে দুটি প্রোটোমের ওভারল্যাপ সংজ্ঞায়িত করতে হবে। যদিও এটি ব্যাপকভাবে স্বীকৃত যে CSF AD মস্তিষ্কের নিউরোকেমিক্যাল পরিবর্তনগুলিকে প্রতিফলিত করে (4), AD মস্তিষ্ক এবং CSF প্রোটিওমের মধ্যে ওভারল্যাপের সঠিক মাত্রা অস্পষ্ট। আমাদের দুটি প্রোটিওমে শনাক্ত করা শেয়ার্ড জিন পণ্যের সংখ্যার তুলনা করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে চিহ্নিত প্রোটিনের প্রায় 70% (n = 1936) মস্তিষ্কেও পরিমাপ করা হয়েছিল (চিত্র 4A)। এই ওভারল্যাপিং প্রোটিনগুলির বেশিরভাগই (n = 1721) আবিষ্কার মস্তিষ্কের ডেটা সেট (চিত্র 4B) থেকে 44টি সহ-অভিব্যক্তি মডিউলের একটিতে ম্যাপ করা হয়েছে। প্রত্যাশিত হিসাবে, ছয়টি বৃহত্তম মস্তিষ্কের মডিউল (M1 থেকে M6) সর্বাধিক পরিমাণে CSF ওভারল্যাপ প্রদর্শন করেছে। যাইহোক, ছোট ব্রেন মডিউল আছে (উদাহরণস্বরূপ, M15 এবং M29) যেগুলি অপ্রত্যাশিতভাবে উচ্চ মাত্রার ওভারল্যাপ অর্জন করে, একটি মস্তিষ্কের মডিউল তার আকারের দ্বিগুণ থেকে বড়। এটি আমাদের মস্তিষ্ক এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের মধ্যে ওভারল্যাপ গণনা করার জন্য আরও বিস্তারিত, পরিসংখ্যানগতভাবে চালিত পদ্ধতি গ্রহণ করতে অনুপ্রাণিত করে।
(A এবং B) আবিষ্কারের মস্তিষ্ক এবং CSF ডেটা সেটগুলিতে সনাক্ত করা প্রোটিনগুলি ওভারল্যাপ করে। এই ওভারল্যাপিং প্রোটিনগুলির বেশিরভাগই মস্তিষ্কের সহ-অভিব্যক্তি নেটওয়ার্কের 44টি সহ-অভিব্যক্তি মডিউলগুলির একটির সাথে যুক্ত। (সি) সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড প্রোটিওম এবং ব্রেন নেটওয়ার্ক প্রোটিওমের মধ্যে ওভারল্যাপ আবিষ্কার করুন। তাপ মানচিত্রের প্রতিটি সারি হাইপারজিওমেট্রিক FET-এর একটি পৃথক ওভারল্যাপ বিশ্লেষণ উপস্থাপন করে। উপরের সারিটি মস্তিষ্কের মডিউল এবং পুরো CSF প্রোটিওমের মধ্যে ওভারল্যাপ (ধূসর/কালো ছায়া) চিত্রিত করে। দ্বিতীয় লাইনে দেখানো হয়েছে যে মস্তিষ্কের মডিউল এবং CSF প্রোটিনের মধ্যে ওভারল্যাপ (লাল রঙের ছায়ায়) AD (P <0.05) এ উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত। তৃতীয় সারি দেখায় যে মস্তিষ্কের মডিউল এবং CSF প্রোটিন (নীল ছায়া) এর মধ্যে ওভারল্যাপ AD (P <0.05) এ উল্লেখযোগ্যভাবে নিম্ন-নিয়ন্ত্রিত। FET থেকে প্রাপ্ত P মান সংশোধন করতে BH পদ্ধতি ব্যবহার করুন। (D) সেল টাইপ অ্যাসোসিয়েশন এবং সম্পর্কিত GO শর্তাবলীর উপর ভিত্তি করে ফোল্ডিং মডিউল প্যানেল। এই প্যানেলে মোট 271টি মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত প্রোটিন রয়েছে, যা CSF প্রোটিওমে অর্থপূর্ণ ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন রয়েছে।
একক-টেইলড এফইটি ব্যবহার করে, আমরা সিএসএফ প্রোটিওম এবং পৃথক মস্তিষ্কের মডিউলগুলির মধ্যে প্রোটিন ওভারল্যাপের গুরুত্ব মূল্যায়ন করেছি। বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে CSF ডেটা সেটে মোট 14টি মস্তিষ্কের মডিউলের পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপ রয়েছে (FDR সামঞ্জস্য করা P <0.05), এবং একটি অতিরিক্ত মডিউল (M18) যার ওভারল্যাপ তাত্পর্যের কাছাকাছি (FDR সামঞ্জস্য করা P = 0.06) (চিত্র 4C) , উপরের সারি)। আমরা এমন মডিউলগুলিতেও আগ্রহী যেগুলি পৃথকভাবে প্রকাশিত CSF প্রোটিনের সাথে দৃঢ়ভাবে ওভারল্যাপ করে। অতএব, আমরা নির্ধারণ করতে দুটি অতিরিক্ত FET বিশ্লেষণ প্রয়োগ করেছি কোনটি (i) CSF প্রোটিন AD তে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং (ii) CSF প্রোটিন উল্লেখযোগ্যভাবে AD তে হ্রাস পেয়েছে (P <0.05, পেয়ারড t টেস্ট AD/নিয়ন্ত্রণ) অর্থপূর্ণ ওভারল্যাপ সহ ব্রেন মডিউল তাদের মধ্যে চিত্র 4C এর মাঝখানে এবং নীচের সারিতে দেখানো হয়েছে, এই অতিরিক্ত বিশ্লেষণগুলি দেখায় যে 44টি মস্তিষ্কের মডিউলগুলির মধ্যে 8টি উল্লেখযোগ্যভাবে AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, এবং M38) এ যুক্ত প্রোটিনের সাথে ওভারল্যাপ করে। . ), যখন শুধুমাত্র দুটি মডিউল (M6 এবং M15) AD CSF-এ হ্রাসকৃত প্রোটিনের সাথে একটি অর্থপূর্ণ ওভারল্যাপ দেখায়। প্রত্যাশিত হিসাবে, সমস্ত 10টি মডিউল 15টি মডিউলের মধ্যে রয়েছে যেখানে CSF প্রোটিওমের সাথে সর্বোচ্চ ওভারল্যাপ রয়েছে। অতএব, আমরা অনুমান করি যে এই 15টি মডিউলগুলি AD মস্তিষ্ক থেকে প্রাপ্ত CSF বায়োমার্কারগুলির উচ্চ-ফলনের উত্স।
আমরা এই 15টি ওভারল্যাপিং মডিউলগুলিকে ডাব্লুজিসিএনএ ট্রি ডায়াগ্রামে তাদের নৈকট্য এবং কোষের প্রকার এবং জিন অন্টোলজি (চিত্র 4D) এর সাথে তাদের সংযোগের ভিত্তিতে পাঁচটি বড় প্রোটিন প্যানেলে ভাঁজ করেছি। প্রথম প্যানেলে নিউরন মার্কার এবং সিন্যাপস-সম্পর্কিত প্রোটিন (M1 এবং M12) সমৃদ্ধ মডিউল রয়েছে। সিনাপটিক প্যানেলে মোট 94টি প্রোটিন রয়েছে এবং CSF প্রোটিওমের স্তরগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছে, এটি পাঁচটি প্যানেলের মধ্যে মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত CSF মার্কারগুলির বৃহত্তম উত্স করে তুলেছে। দ্বিতীয় গ্রুপ (M6 এবং M15) এন্ডোথেলিয়াল সেল মার্কার এবং ভাস্কুলার বডির সাথে ঘনিষ্ঠ সংযোগ প্রদর্শন করেছে, যেমন "ক্ষত নিরাময়" (M6) এবং "হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণ" (M15)। এম 15 লিপোপ্রোটিন বিপাকের সাথেও অত্যন্ত সম্পর্কিত, যা এন্ডোথেলিয়ামের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত (36)। ভাস্কুলার প্যানেলে মস্তিষ্কের সাথে সম্পর্কিত 34টি CSF মার্কার রয়েছে। তৃতীয় গ্রুপে রয়েছে মডিউল (M2 এবং M4) যা উল্লেখযোগ্যভাবে অলিগোডেনড্রোসাইট মার্কার এবং কোষের বিস্তারের সাথে সম্পর্কিত। উদাহরণস্বরূপ, M2-এর উচ্চ-স্তরের অন্টোলজি পদগুলির মধ্যে রয়েছে "ডিএনএ প্রতিলিপির ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ" এবং "পিউরিন বায়োসিন্থেসিস প্রক্রিয়া"। এদিকে, M4 এর মধ্যে রয়েছে "গ্লিয়াল সেল ডিফারেন্সিয়েশন" এবং "ক্রোমোজোম সেগ্রিগেশন"। মাইলিনেশন প্যানেলে মস্তিষ্কের সাথে সম্পর্কিত 49টি CSF মার্কার রয়েছে।
চতুর্থ গোষ্ঠীতে সর্বাধিক মডিউল রয়েছে (M30, M29, M18, M24, এবং M5), এবং প্রায় সমস্ত মডিউলগুলি মাইক্রোগ্লিয়া এবং অ্যাস্ট্রোসাইট মার্কারগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ। মাইলিনেশন প্যানেলের মতো, চতুর্থ প্যানেলে মডিউল (M30, M29, এবং M18) রয়েছে যা কোষের বিস্তারের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। এই গোষ্ঠীর অন্যান্য মডিউলগুলি ইমিউনোলজিকাল পদগুলির সাথে অত্যন্ত সম্পর্কিত, যেমন "ইমিউন এফেক্ট প্রসেস" (M5) এবং "ইমিউন রেসপন্স রেগুলেশন" (M24)। গ্লিয়াল ইমিউন গ্রুপে মস্তিষ্কের সাথে সম্পর্কিত 42টি CSF মার্কার রয়েছে। অবশেষে, শেষ প্যানেলে চারটি মডিউলে (M44, M3, M33, এবং M38) 52টি মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত মার্কার রয়েছে, যার সবকটিই শক্তি সঞ্চয় এবং বিপাকের সাথে সম্পর্কিত। এই মডিউলগুলির মধ্যে বৃহত্তম (M3) মাইটোকন্ড্রিয়ার সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত এবং নিউরন-নির্দিষ্ট মার্কার সমৃদ্ধ। M38 এই মেটাবোলোমের ছোট মডিউল সদস্যদের মধ্যে একটি এবং এটি মাঝারি নিউরন নির্দিষ্টতাও প্রদর্শন করে।
সামগ্রিকভাবে, এই পাঁচটি প্যানেল AD কর্টেক্সে কোষের প্রকার এবং ফাংশনের বিস্তৃত পরিসরকে প্রতিফলিত করে এবং সম্মিলিতভাবে 271টি মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত CSF মার্কার (টেবিল S2G) ধারণ করে। এই এমএস ফলাফলগুলির বৈধতা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা প্রক্সিমিটি এক্সটেনশন অ্যাস (পিইএ) ব্যবহার করেছি, মাল্টিপ্লেক্সিং ক্ষমতা, উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং নির্দিষ্টতা সহ একটি অর্থোগোনাল অ্যান্টিবডি-ভিত্তিক প্রযুক্তি এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড নমুনাগুলিকে আমরা এই 271টি বায়োমার্কারের একটি উপসেট খুঁজে পেয়েছি। (n = 36)। এই 36টি লক্ষ্যগুলি PEA-এর AD মাল্টিপল-এর ​​পরিবর্তন প্রদর্শন করে, যা আমাদের MS-ভিত্তিক অনুসন্ধানের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), যা আমাদের ব্যাপক MS বিশ্লেষণের ফলাফলগুলিকে দৃঢ়ভাবে যাচাই করেছে (চিত্র S4) )
আমাদের পাঁচটি গোষ্ঠীর দ্বারা জোর দেওয়া জৈবিক থিমগুলি, সিনাপটিক সংকেত থেকে শক্তি বিপাক পর্যন্ত, সবই AD (1-3) এর প্যাথোজেনেসিসের সাথে সম্পর্কিত। অতএব, এই প্যানেলগুলি ধারণকারী সমস্ত 15 টি মডিউল মস্তিষ্কের প্রোটিওমের AD প্যাথলজির সাথে সম্পর্কিত যা আমরা আবিষ্কার করেছি (চিত্র 2B)। সবচেয়ে উল্লেখযোগ্য হল আমাদের গ্লিয়াল মডিউলগুলির মধ্যে উচ্চ ইতিবাচক প্যাথলজিকাল পারস্পরিক সম্পর্ক এবং আমাদের বৃহত্তম নিউরোনাল মডিউলগুলির (M1 এবং M3) মধ্যে শক্তিশালী নেতিবাচক প্যাথলজিকাল পারস্পরিক সম্পর্ক। আমাদের প্রতিলিপিকৃত মস্তিষ্কের প্রোটিওম (চিত্র S3D) এর ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ M5 এবং M18-প্রাপ্ত গ্লিয়াল প্রোটিনগুলিকেও হাইলাইট করে। AsymAD এবং উপসর্গযুক্ত AD-তে, সর্বাধিক বর্ধিত গ্লিয়াল প্রোটিন এবং M1-সম্পর্কিত সিন্যাপসে প্রোটিন সবচেয়ে বেশি হ্রাস পায়। এই পর্যবেক্ষণগুলি ইঙ্গিত দেয় যে আমরা পাঁচটি গ্রুপে চিহ্নিত 271 সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড মার্কারগুলি AD কর্টেক্সের রোগ প্রক্রিয়াগুলির সাথে সম্পর্কিত, যেগুলি প্রাথমিক অ্যাসিম্পটমেটিক পর্যায়ে ঘটে।
মস্তিষ্ক এবং মেরুদন্ডের তরল প্যানেল প্রোটিনের পরিবর্তনের দিকটি আরও ভালভাবে বিশ্লেষণ করার জন্য, আমরা 15টি ওভারল্যাপিং মডিউলগুলির প্রতিটির জন্য নিম্নলিখিতগুলি আঁকলাম: (i) মস্তিষ্কের ডেটা সেটে মডিউল প্রাচুর্যের স্তর খুঁজে পেয়েছি এবং (ii) মডিউল প্রোটিন পার্থক্যটি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (চিত্র S5) এ প্রকাশ করা হয়। পূর্বে উল্লিখিত হিসাবে, WGCNA মস্তিষ্কে মডিউল প্রাচুর্য বা বৈশিষ্ট্যযুক্ত প্রোটিন মান নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয় (13)। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (AD/নিয়ন্ত্রণ) এ মডুলার প্রোটিনের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন বর্ণনা করতে আগ্নেয়গিরির মানচিত্র ব্যবহার করা হয়। এই পরিসংখ্যানগুলি দেখায় যে পাঁচটি প্যানেলের মধ্যে তিনটি মস্তিষ্ক এবং মেরুদণ্ডের তরলে ভিন্ন অভিব্যক্তি প্রবণতা দেখায়। সিন্যাপস প্যানেলের দুটি মডিউল (M1 এবং M12) AD মস্তিষ্কে প্রাচুর্যের মাত্রা হ্রাস দেখায়, কিন্তু উল্লেখযোগ্যভাবে AD CSF (চিত্র S5A) এ বর্ধিত প্রোটিনের সাথে ওভারল্যাপ করে। মেটাবোলোম (M3 এবং M38) ধারণকারী নিউরন-সম্পর্কিত মডিউলগুলি একই রকম মস্তিষ্ক এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এক্সপ্রেশন প্যাটার্নগুলি অসামঞ্জস্যপূর্ণ (চিত্র S5E) দেখিয়েছে। ভাস্কুলার প্যানেলটি বিভিন্ন অভিব্যক্তি প্রবণতাও দেখিয়েছিল, যদিও এর মডিউলগুলি (M6 এবং M15) AD মস্তিষ্কে মাঝারিভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল এবং রোগাক্রান্ত CSF (চিত্র S5B) এ হ্রাস পেয়েছে। অবশিষ্ট দুটি প্যানেলে বড় গ্লিয়াল নেটওয়ার্ক রয়েছে যার প্রোটিনগুলি উভয় বগিতে ধারাবাহিকভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয় (চিত্র S5, C এবং D)।
অনুগ্রহ করে মনে রাখবেন যে এই প্রবণতাগুলি এই প্যানেলের সমস্ত মার্কারগুলির জন্য সাধারণ নয়৷ উদাহরণস্বরূপ, সিনাপটিক প্যানেলে বেশ কয়েকটি প্রোটিন রয়েছে যা AD মস্তিষ্ক এবং CSF (চিত্র S5A) এ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। এই ডাউন-নিয়ন্ত্রিত সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড মার্কারগুলির মধ্যে হল NPTX2 এবং M1-এর VGF, এবং M12-এর ক্রোমোগ্রানিন বি। যাইহোক, এই ব্যতিক্রমগুলি সত্ত্বেও, আমাদের বেশিরভাগ সিন্যাপটিক মার্কারগুলি AD মেরুদণ্ডের তরলে উন্নত হয়। সামগ্রিকভাবে, এই বিশ্লেষণগুলি আমাদের পাঁচটি প্যানেলের প্রতিটিতে মস্তিষ্ক এবং সেরিব্রোস্পাইনাল তরল স্তরের পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য প্রবণতাগুলিকে আলাদা করতে সক্ষম হয়েছিল। এই প্রবণতাগুলি AD-তে মস্তিষ্ক এবং CSF প্রোটিন অভিব্যক্তির মধ্যে জটিল এবং প্রায়শই ভিন্ন সম্পর্ককে হাইলাইট করে।
তারপরে, আমরা উচ্চ-থ্রুপুট এমএস প্রতিলিপি বিশ্লেষণ (CSF প্রতিলিপি 1) ব্যবহার করেছি আমাদের 271 সেট বায়োমার্কারকে সবচেয়ে প্রতিশ্রুতিশীল এবং পুনরুত্পাদনযোগ্য লক্ষ্যে (চিত্র 5A) সংকুচিত করতে। CSF কপি 1 এ Emory Goizueta ADRC থেকে মোট 96টি নমুনা রয়েছে, যার মধ্যে নিয়ন্ত্রণ, AsymAD এবং AD কোহর্ট (টেবিল S1A) রয়েছে। এই AD কেসগুলি হালকা জ্ঞানীয় হ্রাস (মানে MoCA, 20.0 ± 3.8) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (টেবিল S1A) এ নিশ্চিত হওয়া AD বায়োমার্কারের পরিবর্তন দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। আমরা যে CSF বিশ্লেষণ পেয়েছি তার বিপরীতে, এই প্রতিলিপিটি আরও দক্ষ এবং উচ্চ-থ্রুপুট "একক-শট" MS পদ্ধতি (অফ-লাইন ভগ্নাংশ ছাড়া) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়, একটি সরলীকৃত নমুনা প্রস্তুতি প্রোটোকল সহ যা পৃথক নমুনার প্রতিরোধের প্রয়োজনীয়তা দূর করে। . পরিবর্তে, একটি একক ইমিউন-ক্ষয়প্রাপ্ত "বর্ধিতকরণ চ্যানেল" কম প্রচুর প্রোটিনের সংকেতকে প্রশস্ত করতে ব্যবহৃত হয় (37)। যদিও এটি মোট প্রোটিওম কভারেজ হ্রাস করে, এই একক-শট পদ্ধতিটি উল্লেখযোগ্যভাবে মেশিনের সময় হ্রাস করে এবং টিএমটি-লেবেলযুক্ত নমুনার সংখ্যা বৃদ্ধি করে যা কার্যকর বিশ্লেষণ করা যেতে পারে (17, 38)। মোট, বিশ্লেষণটি 6,487 পেপটাইড সনাক্ত করেছে, যা 96 টি ক্ষেত্রে 1,183 প্রোটিওমে ম্যাপ করেছে। CSF বিশ্লেষণের মতো আমরা পেয়েছি, নমুনার কমপক্ষে 50% পরিমাণে কেবলমাত্র সেই প্রোটিনগুলিকে পরবর্তী গণনাগুলিতে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল এবং বয়স এবং লিঙ্গের প্রভাবের জন্য ডেটা প্রত্যাহার করা হয়েছিল। এটি 792 প্রোটিওমের চূড়ান্ত পরিমাণের দিকে পরিচালিত করে, যার মধ্যে 95% CSF ডেটা সেটেও সনাক্ত করা হয়েছিল।
(A) মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত CSF প্রোটিন লক্ষ্যগুলি প্রথম প্রতিলিপিকৃত CSF কোহর্টে যাচাই করা হয়েছে এবং চূড়ান্ত প্যানেলে অন্তর্ভুক্ত (n = 60)। (B থেকে E) প্যানেল বায়োমার্কার স্তরগুলি (যৌগিক z-স্কোর) চারটি CSF প্রতিলিপি দলে পরিমাপ করা হয়েছে৷ প্রতিটি প্রতিলিপি বিশ্লেষণে প্রাচুর্যের পরিবর্তনের পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য মূল্যায়ন করতে Tukey-এর পোস্ট-কারেকশনের সাথে পেয়ার করা টি-পরীক্ষা বা ANOVA ব্যবহার করা হয়েছিল। সিটি, নিয়ন্ত্রণ।
যেহেতু আমরা ব্যাপক বিশ্লেষণের মাধ্যমে আমাদের 271 মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত CSF লক্ষ্যগুলি যাচাই করতে বিশেষভাবে আগ্রহী, তাই আমরা এই প্রতিলিপিযুক্ত প্রোটিওমের আরও পরীক্ষা এই মার্কারগুলিতে সীমাবদ্ধ করব। এই 271টি প্রোটিনের মধ্যে, 100টি CSF প্রতিলিপিতে সনাক্ত করা হয়েছে। চিত্র S6A নিয়ন্ত্রণ এবং AD প্রতিলিপি নমুনার মধ্যে এই 100টি ওভারল্যাপিং মার্কারগুলির ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন দেখায়। সিনাপটিক এবং মেটাবোলাইট হিস্টোনগুলি AD-তে সবচেয়ে বেশি বৃদ্ধি পায়, যখন ভাস্কুলার প্রোটিন রোগে সবচেয়ে বেশি হ্রাস পায়। 100টি ওভারল্যাপিং মার্কারগুলির বেশিরভাগই (n = 70) দুটি ডেটা সেটে পরিবর্তনের একই দিক বজায় রেখেছে (চিত্র S6B)। এই 70টি বৈধ মস্তিষ্ক-সম্পর্কিত CSF মার্কারগুলি (টেবিল S2H) মূলত পূর্বে পর্যবেক্ষণ করা প্যানেল অভিব্যক্তি প্রবণতাকে প্রতিফলিত করে, অর্থাৎ, ভাস্কুলার প্রোটিনের ডাউন-নিয়ন্ত্রণ এবং অন্যান্য সমস্ত প্যানেলের আপ-নিয়ন্ত্রণ। এই 70টি বৈধ প্রোটিনের মধ্যে মাত্র 10টি AD প্রাচুর্যের পরিবর্তন দেখিয়েছে যা এই প্যানেল প্রবণতাগুলির বিরোধিতা করে। একটি প্যানেল তৈরি করার জন্য যা মস্তিষ্ক এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের সামগ্রিক প্রবণতাকে সর্বোত্তমভাবে প্রতিফলিত করে, আমরা এই 10টি প্রোটিনকে আগ্রহের প্যানেল থেকে বাদ দিয়েছি যা আমরা অবশেষে যাচাই করেছি (চিত্র 5A)। অতএব, আমাদের প্যানেলে শেষ পর্যন্ত বিভিন্ন নমুনা প্রস্তুতি এবং এমএস প্ল্যাটফর্ম বিশ্লেষণ ব্যবহার করে দুটি স্বাধীন CSF AD কোহর্টে যাচাই করা মোট 60টি প্রোটিন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। CSF কপি 1 কন্ট্রোল এবং AD ক্ষেত্রে এই চূড়ান্ত প্যানেলের জেড-স্কোর এক্সপ্রেশন প্লটগুলি আমাদের পাওয়া CSF কোহর্টে পরিলক্ষিত প্যানেলের প্রবণতা নিশ্চিত করেছে (চিত্র 5B)।
এই 60টি প্রোটিনের মধ্যে, AD এর সাথে সম্পর্কিত বলে পরিচিত অণু রয়েছে, যেমন অস্টিওপন্টিন (SPP1), যা একটি প্রো-ইনফ্লেমেটরি সাইটোকাইন যা অনেক গবেষণায় (39-41), এবং GAP43, একটি সিনাপটিক প্রোটিন যা স্পষ্টভাবে নিউরোডিজেনারেশনের সাথে যুক্ত (42)। সবচেয়ে সম্পূর্ণরূপে যাচাইকৃত প্রোটিন হল অন্যান্য নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের সাথে সম্পর্কিত চিহ্নিতকারী, যেমন অ্যামায়োট্রফিক ল্যাটারাল স্ক্লেরোসিস (ALS) সম্পর্কিত সুপারঅক্সাইড ডিসম্যুটেজ 1 (SOD1) এবং পারকিনসন রোগ সম্পর্কিত desaccharase (PARK7)। আমরা আরও যাচাই করেছি যে SMOC1 এবং মস্তিষ্ক-সমৃদ্ধ ঝিল্লি সংযুক্তি সংকেত প্রোটিন 1 (BASP1) এর মতো অন্যান্য অনেক চিহ্নিতকারীর নিউরোডিজেনারেশনের পূর্ববর্তী লিঙ্কগুলি সীমিত রয়েছে। এটি লক্ষণীয় যে CSF প্রোটিওমে তাদের সামগ্রিক প্রাচুর্য কম থাকার কারণে, MAPT এবং নির্দিষ্ট অন্যান্য AD-সম্পর্কিত প্রোটিনগুলি (উদাহরণস্বরূপ, NEFL এবং NRGN) নির্ভরযোগ্যভাবে সনাক্ত করতে এই উচ্চ-থ্রুপুট একক-শট সনাক্তকরণ পদ্ধতি ব্যবহার করা আমাদের পক্ষে কঠিন। ) ( 43, 44)।
তারপরে আমরা তিনটি অতিরিক্ত প্রতিলিপি বিশ্লেষণে এই 60টি অগ্রাধিকার প্যানেল মার্কারগুলি পরীক্ষা করেছি। CSF কপি 2-এ, আমরা Emory Goizueta ADRC (17) থেকে 297 নিয়ন্ত্রণের একটি স্বাধীন দল এবং AD নমুনা বিশ্লেষণ করতে একটি একক TMT-MS ব্যবহার করেছি। CSF রেপ্লিকেশন 3 এর মধ্যে 120 টি কন্ট্রোল থেকে পাওয়া TMT-MS ডেটার পুনঃবিশ্লেষণ এবং সুইজারল্যান্ডের লাউসেন (45) এডি রোগীদের অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে। আমরা প্রতিটি ডেটাসেটে 60টি অগ্রাধিকার চিহ্নিতকারীর দুই-তৃতীয়াংশের বেশি সনাক্ত করেছি। যদিও সুইস গবেষণায় বিভিন্ন এমএস প্ল্যাটফর্ম এবং টিএমটি পরিমাপ পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছে (45, 46), আমরা দুটি পুনরাবৃত্ত বিশ্লেষণে (চিত্র 5, C এবং D, এবং টেবিল S2, I, এবং J) দৃঢ়ভাবে আমাদের প্যানেল প্রবণতাগুলি পুনরুত্পাদন করেছি। আমাদের গ্রুপের রোগের নির্দিষ্টতা মূল্যায়ন করতে, আমরা চতুর্থ প্রতিলিপি ডেটা সেট (CSF প্রতিলিপি 4) বিশ্লেষণ করতে TMT-MS ব্যবহার করেছি, যার মধ্যে শুধুমাত্র নিয়ন্ত্রণ (n = 18) এবং AD (n = 17) কেসই অন্তর্ভুক্ত ছিল না, PD ( n = 14)), ALS (n = 18) এবং ফ্রন্টোটেম্পোরাল ডিমেনশিয়া (এফটিডি) নমুনা (n = 11) (টেবিল S1A)। আমরা এই দলে প্যানেল প্রোটিনের প্রায় দুই-তৃতীয়াংশ সফলভাবে পরিমাপ করেছি (60 এর মধ্যে 38)। এই ফলাফলগুলি সমস্ত পাঁচটি বায়োমার্কার প্যানেলে AD-নির্দিষ্ট পরিবর্তনগুলিকে হাইলাইট করে (চিত্র 5E এবং টেবিল S2K)। মেটাবোলাইট গ্রুপের বৃদ্ধি সবচেয়ে শক্তিশালী এডি নির্দিষ্টতা দেখিয়েছে, তার পরে মায়লিনেশন এবং গ্লিয়াল গ্রুপ। অল্প পরিমাণে, FTD এই প্যানেলের মধ্যে বৃদ্ধিও দেখায়, যা অনুরূপ সম্ভাব্য নেটওয়ার্ক পরিবর্তনগুলি প্রতিফলিত করতে পারে (17)। বিপরীতে, ALS এবং PD নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠী হিসাবে প্রায় একই মায়লিনেশন, গ্লিয়াল এবং মেটাবোলোম প্রোফাইল দেখিয়েছে। সামগ্রিকভাবে, নমুনা প্রস্তুতি, এমএস প্ল্যাটফর্ম এবং টিএমটি পরিমাপ পদ্ধতিতে পার্থক্য থাকা সত্ত্বেও, এই বারবার বিশ্লেষণগুলি দেখায় যে আমাদের অগ্রাধিকার প্যানেল মার্কারগুলির 500 টিরও বেশি অনন্য CSF নমুনায় অত্যন্ত সামঞ্জস্যপূর্ণ AD-নির্দিষ্ট পরিবর্তন রয়েছে।
জ্ঞানীয় উপসর্গের সূত্রপাতের বেশ কয়েক বছর আগে AD নিউরোডিজেনারেশন ব্যাপকভাবে স্বীকৃত হয়েছে, তাই AsymAD (5, 31) এর বায়োমার্কারের জরুরী প্রয়োজন রয়েছে। যাইহোক, আরও বেশি সংখ্যক প্রমাণ দেখায় যে AsymAD এর জীববিজ্ঞান একজাতীয় থেকে অনেক দূরে, এবং ঝুঁকি এবং স্থিতিস্থাপকতার জটিল মিথস্ক্রিয়া পরবর্তী রোগের অগ্রগতিতে বড় ব্যক্তিগত পার্থক্যের দিকে পরিচালিত করে (47)। যদিও AsymAD কেস শনাক্ত করার জন্য ব্যবহার করা হয়, কোর CSF বায়োমার্কার (Aβ1-42, মোট টাউ এবং পি-টাউ) এর স্তরগুলি বিশ্বাসযোগ্যভাবে ভবিষ্যদ্বাণী করতে সক্ষম নয় যে কে ডিমেনশিয়ায় অগ্রসর হবে (4, 7), এটি আরও ইঙ্গিত করে। এই জনসংখ্যার ঝুঁকি সঠিকভাবে স্তরিত করার জন্য মস্তিষ্কের শারীরবৃত্তির একাধিক দিকের উপর ভিত্তি করে হোলিস্টিক বায়োমার্কার সরঞ্জামগুলি অন্তর্ভুক্ত করা প্রয়োজন। অতএব, আমরা পরবর্তীতে CSF অনুলিপি 1 এর AsymAD জনসংখ্যাতে আমাদের AD-প্রমাণিত বায়োমার্কার প্যানেল বিশ্লেষণ করেছি। এই 31টি AsymAD ক্ষেত্রে অস্বাভাবিক কোর বায়োমার্কার স্তর দেখায় (Aβ1–42/মোট টাউ ELISA অনুপাত, <5.5) এবং সম্পূর্ণ জ্ঞান (মানে MoCA, 27)। ± 2.2) (টেবিল S1A)। এছাড়াও, AsymAD-এ আক্রান্ত সকল ব্যক্তির ক্লিনিকাল ডিমেনশিয়া স্কোর 0 রয়েছে, যা নির্দেশ করে যে দৈনিক জ্ঞানীয় বা কার্যকরী কর্মক্ষমতা হ্রাসের কোন প্রমাণ নেই।
আমরা প্রথমে AsymAD কোহর্ট সহ 96 টি CSF রেপ্লিকেট 1-এ বৈধ প্যানেলের স্তরগুলি বিশ্লেষণ করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে AsymAD গ্রুপের বেশ কয়েকটি প্যানেলে উল্লেখযোগ্য AD-এর মতো প্রাচুর্য পরিবর্তন রয়েছে, ভাস্কুলার প্যানেল AsymAD-এ নিম্নগামী প্রবণতা দেখিয়েছে, যখন অন্যান্য সমস্ত প্যানেল একটি ঊর্ধ্বমুখী প্রবণতা দেখিয়েছে (চিত্র 6A)। অতএব, সমস্ত প্যানেল ELISA Aβ1-42 এবং মোট টাউ স্তরের (চিত্র 6B) সাথে একটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ সম্পর্ক দেখিয়েছে। বিপরীতে, গ্রুপ এবং MoCA স্কোরের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক তুলনামূলকভাবে খারাপ। এই বিশ্লেষণগুলি থেকে আরও আকর্ষণীয় ফলাফলগুলির মধ্যে একটি হল AsymAD কোহর্টে প্যানেলের প্রাচুর্যের বিশাল পরিসর। চিত্র 6A তে দেখানো হয়েছে, AsymAD গ্রুপের প্যানেল স্তর সাধারণত নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ এবং AD গ্রুপের প্যানেল স্তর অতিক্রম করে, তুলনামূলকভাবে উচ্চ পরিবর্তনশীলতা দেখায়। AsymAD এর এই ভিন্নতা আরও অন্বেষণ করতে, আমরা 96 CSF প্রতিলিপি 1 ক্ষেত্রে বহুমাত্রিক স্কেলিং (MDS) বিশ্লেষণ প্রয়োগ করেছি। এমডিএস বিশ্লেষণ ডেটা সেটের নির্দিষ্ট ভেরিয়েবলের উপর ভিত্তি করে কেসের মধ্যে সাদৃশ্য কল্পনা করতে দেয়। এই ক্লাস্টার বিশ্লেষণের জন্য, আমরা কেবলমাত্র সেই বৈধ প্যানেল মার্কারগুলি ব্যবহার করি যেগুলির CSF আবিষ্কার এবং প্রতিলিপি 1 প্রোটিওম (n = 29) (টেবিল S2L) স্তরে পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন (P <0.05, AD/নিয়ন্ত্রণ) রয়েছে৷ এই বিশ্লেষণটি আমাদের নিয়ন্ত্রণ এবং AD কেস (চিত্র 6C) এর মধ্যে স্পষ্ট স্থানিক ক্লাস্টারিং তৈরি করেছে। বিপরীতে, কিছু AsymAD কেস স্পষ্টভাবে কন্ট্রোল গ্রুপে ক্লাস্টার করা হয়, অন্যরা AD ক্ষেত্রে অবস্থিত। এই AsymAD ভিন্নতা আরও অন্বেষণ করতে, আমরা এই AsymAD ক্ষেত্রে দুটি গ্রুপ সংজ্ঞায়িত করতে আমাদের MDS মানচিত্র ব্যবহার করেছি। প্রথম গ্রুপে AsymAD কেসগুলি অন্তর্ভুক্ত ছিল যা নিয়ন্ত্রণের কাছাকাছি ক্লাস্টার করা হয়েছে (n = 19), যখন দ্বিতীয় গ্রুপটি AD (n = 12) এর কাছাকাছি মার্কার প্রোফাইল সহ AsymAD কেস দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল।
(A) AsymAD সহ CSF রেপ্লিকেশন 1 কোহর্টের সমস্ত 96 টি নমুনায় CSF বায়োমার্কার গ্রুপের এক্সপ্রেশন লেভেল (z-স্কোর)। Tukey এর পোস্ট-কারেকশনের সাথে বৈচিত্র্যের বিশ্লেষণ প্যানেলের প্রাচুর্য পরিবর্তনের পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। (বি) প্যানেল প্রোটিন প্রাচুর্য স্তরের (z-স্কোর) সাথে MoCA স্কোর এবং ELISA Aβ1-42 এবং CSF কপি 1 নমুনায় মোট টাউ স্তরের পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ। প্রাসঙ্গিক P মানের সাথে পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ প্রদর্শিত হয়। (C) 96 টি CSF কপি 1 কেসের MDS 29টি বৈধ প্যানেল মার্কারগুলির প্রাচুর্য মাত্রার উপর ভিত্তি করে তৈরি করা হয়েছিল, যা আবিষ্কার এবং CSF কপি 1 ডেটা সেট [P <0.05 AD/control (CT)] উভয় ক্ষেত্রেই উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছিল। এই বিশ্লেষণটি AsymAD গ্রুপকে নিয়ন্ত্রণ (n = 19) এবং AD (n = 12) উপগোষ্ঠীতে বিভক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। (D) আগ্নেয়গিরির প্লটটি দুটি AsymAD উপগোষ্ঠীর মধ্যে -log10 পরিসংখ্যানগত P মানের সাথে সম্পর্কিত log2 ভাঁজ পরিবর্তন (x-অক্ষ) সহ সমস্ত CSF প্রতিলিপি 1 প্রোটিনের ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন দেখায়। প্যানেল বায়োমার্কার রঙিন হয়. (E) CSF প্রতিলিপি 1 প্রাচুর্য স্তর নির্বাচন গ্রুপ বায়োমার্কার AsymAD উপগোষ্ঠীর মধ্যে ভিন্নভাবে প্রকাশ করা হয়। পরিসংখ্যানগত তাৎপর্য মূল্যায়ন করতে Tukey-এর পোস্ট-সামঞ্জস্য বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল।
আমরা এই নিয়ন্ত্রণ এবং AD-এর মতো AsymAD কেস (চিত্র 6D এবং টেবিল S2L) এর মধ্যে ডিফারেনশিয়াল প্রোটিন এক্সপ্রেশন পরীক্ষা করেছি। ফলে আগ্নেয়গিরির মানচিত্র দেখায় যে 14টি প্যানেল চিহ্নিতকারী দুটি গ্রুপের মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছে। এই মার্কারগুলির বেশিরভাগই সিন্যাপস এবং মেটাবোলোমের সদস্য। যাইহোক, SOD1 এবং myristoylated অ্যালানাইন-সমৃদ্ধ প্রোটিন কাইনেজ সি সাবস্ট্রেট (MARCKS), যা যথাক্রমে মাইলিন এবং গ্লিয়াল ইমিউন গ্রুপের সদস্য, এছাড়াও এই গ্রুপের অন্তর্গত (চিত্র 6, D এবং E)। ভাস্কুলার প্যানেল দুটি চিহ্নিতকারীকেও অবদান রেখেছিল যা AD-এর মতো AsymAD গ্রুপে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যার মধ্যে AE বাইন্ডিং প্রোটিন 1 (AEBP1) এবং পরিপূরক পরিবারের সদস্য C9 রয়েছে। ELISA AB1-42 (P = 0.38) এবং p-tau (P = 0.28) এ নিয়ন্ত্রণ এবং AD-এর মতো AsymAD সাবগ্রুপগুলির মধ্যে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না, কিন্তু প্রকৃতপক্ষে মোট টাউ স্তরে একটি উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল (P = 0.0031) ) (চিত্র S7)। বেশ কয়েকটি প্যানেল চিহ্নিতকারী রয়েছে যা নির্দেশ করে যে দুটি AsymAD উপগোষ্ঠীর মধ্যে পরিবর্তনগুলি মোট টাউ স্তরের (উদাহরণস্বরূপ, YWHAZ, SOD1, এবং MDH1) (চিত্র 6E) থেকে বেশি তাৎপর্যপূর্ণ। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে আমাদের বৈধ প্যানেলে বায়োমার্কার থাকতে পারে যা উপসর্গবিহীন রোগে আক্রান্ত রোগীদের সাব-টাইপ এবং সম্ভাব্য ঝুঁকি স্তরবিন্যাস করতে পারে।
AD এর পিছনে বিভিন্ন প্যাথোফিজিওলজিকে আরও ভালভাবে পরিমাপ করতে এবং লক্ষ্য করার জন্য সিস্টেম-ভিত্তিক বায়োমার্কার সরঞ্জামগুলির একটি জরুরি প্রয়োজন রয়েছে। এই সরঞ্জামগুলি শুধুমাত্র আমাদের AD ডায়াগনস্টিক ফ্রেমওয়ার্ক পরিবর্তন করবে না, তবে কার্যকর, রোগী-নির্দিষ্ট চিকিত্সা কৌশল (1, 2) গ্রহণের প্রচার করবে বলে আশা করা হচ্ছে। এই লক্ষ্যে, আমরা ওয়েব-ভিত্তিক CSF বায়োমার্কারগুলি সনাক্ত করতে AD মস্তিষ্ক এবং CSF-এ একটি নিরপেক্ষ ব্যাপক প্রোটিওমিক্স পদ্ধতি প্রয়োগ করেছি যা মস্তিষ্ক-ভিত্তিক প্যাথোফিজিওলজির বিস্তৃত পরিসরকে প্রতিফলিত করে। আমাদের বিশ্লেষণ পাঁচটি CSF বায়োমার্কার প্যানেল তৈরি করেছে, যা (i) সিন্যাপ্স, রক্তনালী, মাইলিন, ইমিউন এবং বিপাকীয় কর্মহীনতা প্রতিফলিত করে; (ii) বিভিন্ন এমএস প্ল্যাটফর্মে শক্তিশালী প্রজননযোগ্যতা প্রদর্শন করা; (iii) AD এর প্রথম ও শেষ পর্যায়ে প্রগতিশীল রোগ-নির্দিষ্ট পরিবর্তন দেখান। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি AD গবেষণা এবং ক্লিনিকাল অ্যাপ্লিকেশনগুলির জন্য বিভিন্ন, নির্ভরযোগ্য, ওয়েব-ভিত্তিক বায়োমার্কার সরঞ্জামগুলির বিকাশের দিকে একটি প্রতিশ্রুতিবদ্ধ পদক্ষেপের প্রতিনিধিত্ব করে।
আমাদের ফলাফলগুলি AD ব্রেন নেটওয়ার্ক প্রোটিওমের অত্যন্ত সংরক্ষিত সংগঠন প্রদর্শন করে এবং সিস্টেম-ভিত্তিক বায়োমার্কার বিকাশের জন্য একটি অ্যাঙ্কর হিসাবে এর ব্যবহারকে সমর্থন করে। আমাদের বিশ্লেষণ দেখায় যে AD এবং AsymAD মস্তিষ্ক ধারণকারী দুটি স্বাধীন TMT-MS ডেটাসেটের শক্তিশালী মডুলারিটি রয়েছে। এই ফলাফলগুলি আমাদের পূর্ববর্তী কাজকে প্রসারিত করে, ফ্রন্টাল, প্যারিটাল এবং টেম্পোরাল কর্টেক্স (17) এর একাধিক স্বাধীন কোহর্ট থেকে 2,000 টিরও বেশি মস্তিষ্কের টিস্যুগুলির শক্তিশালী মডিউলগুলির সংরক্ষণ প্রদর্শন করে। এই ঐক্যমত্য নেটওয়ার্কটি বর্তমান গবেষণায় পরিলক্ষিত বিভিন্ন রোগ-সম্পর্কিত পরিবর্তনগুলিকে প্রতিফলিত করে, যার মধ্যে গ্লিয়াল-সমৃদ্ধ প্রদাহজনক মডিউলের বৃদ্ধি এবং নিউরন-সমৃদ্ধ মডিউলগুলির হ্রাস সহ। বর্তমান গবেষণার মতো, এই বৃহৎ-স্কেল নেটওয়ার্কটি AsymAD-তে উল্লেখযোগ্য মডুলার পরিবর্তনগুলিও বৈশিষ্ট্যযুক্ত করে, যা বিভিন্ন প্রিক্লিনিকাল প্যাথোফিজিওলজি (17) এর বৈচিত্র্য দেখায়।
যাইহোক, এই অত্যন্ত রক্ষণশীল সিস্টেম-ভিত্তিক কাঠামোর মধ্যে, আরও সূক্ষ্ম-দানাযুক্ত জৈবিক ভিন্নতা রয়েছে, বিশেষ করে AD-এর প্রাথমিক পর্যায়ে ব্যক্তিদের মধ্যে। আমাদের বায়োমার্কার প্যানেল AsymAD এ দুটি উপগোষ্ঠী চিত্রিত করতে সক্ষম, যা একাধিক CSF মার্কারগুলির উল্লেখযোগ্য ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশন প্রদর্শন করে। আমাদের গ্রুপ এই দুটি উপগোষ্ঠীর মধ্যে জৈবিক পার্থক্য হাইলাইট করতে সক্ষম হয়েছিল, যা মূল এডি বায়োমার্কারের স্তরে স্পষ্ট ছিল না। কন্ট্রোল গ্রুপের সাথে তুলনা করে, এই AsymAD ব্যক্তিদের Aβ1-42/মোট টাউ অনুপাত অস্বাভাবিকভাবে কম ছিল। যাইহোক, শুধুমাত্র মোট টাউ স্তর দুটি AsymAD উপগোষ্ঠীর মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল, যখন Aβ1-42 এবং পি-টাউ স্তরগুলি তুলনামূলকভাবে তুলনীয় ছিল। যেহেতু উচ্চ CSF টাউ Aβ1-42 স্তরের (7) তুলনায় জ্ঞানীয় লক্ষণগুলির একটি ভাল ভবিষ্যদ্বাণী বলে মনে হয়, তাই আমরা সন্দেহ করি যে দুটি AsymAD সমগোত্রের রোগের অগ্রগতির বিভিন্ন ঝুঁকি থাকতে পারে। আমাদের AsymAD এর সীমিত নমুনার আকার এবং অনুদৈর্ঘ্য ডেটার অভাবের কারণে, এই সিদ্ধান্তগুলি আত্মবিশ্বাসের সাথে আঁকতে আরও গবেষণা প্রয়োজন। যাইহোক, এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে একটি সিস্টেম-ভিত্তিক CSF প্যানেল রোগের উপসর্গহীন পর্যায়ে কার্যকরভাবে ব্যক্তিদের স্তরবিন্যাস করার ক্ষমতা বাড়াতে পারে।
সামগ্রিকভাবে, আমাদের অনুসন্ধানগুলি AD এর প্যাথোজেনেসিসে একাধিক জৈবিক ফাংশনের ভূমিকাকে সমর্থন করে। যাইহোক, অনিয়ন্ত্রিত শক্তি বিপাক আমাদের পাঁচটি বৈধ লেবেলিং প্যানেলের বিশিষ্ট থিম হয়ে উঠেছে। বিপাকীয় প্রোটিন, যেমন hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) এবং ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজেনেস A (LDHA), হল সবচেয়ে দৃঢ়ভাবে যাচাইকৃত সিনাপটিক বায়োমার্কার, যা নির্দেশ করে যে AD CSF-এর বৃদ্ধি অত্যন্ত প্রজননযোগ্য যৌনতা। আমাদের রক্তনালী এবং গ্লিয়াল প্যানেলে অক্সিডেটিভ পদার্থের বিপাকের সাথে জড়িত বেশ কয়েকটি মার্কার রয়েছে। এই ফলাফলগুলি সমগ্র মস্তিষ্কে বিপাকীয় প্রক্রিয়াগুলি যে মূল ভূমিকা পালন করে তার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, শুধুমাত্র নিউরনের উচ্চ শক্তির চাহিদা মেটাতে নয়, অ্যাস্ট্রোসাইট এবং অন্যান্য গ্লিয়াল কোষগুলির উচ্চ শক্তির চাহিদা মেটাতেও (17, 48)। আমাদের ফলাফলগুলি ক্রমবর্ধমান প্রমাণকে সমর্থন করে যে রেডক্স সম্ভাবনার পরিবর্তন এবং শক্তির পথের বাধা হতে পারে এডির প্যাথোজেনেসিসের সাথে জড়িত কয়েকটি মূল প্রক্রিয়ার মধ্যে মূল যোগসূত্র, যার মধ্যে রয়েছে মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসঅর্ডার, গ্লিয়াল-মধ্যস্থ প্রদাহ এবং ভাস্কুলার ক্ষতি (49)। এছাড়াও, বিপাকীয় সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড বায়োমার্কারগুলিতে আমাদের নিয়ন্ত্রণ এবং AD-এর মতো AsymAD সাবগ্রুপগুলির মধ্যে প্রচুর পরিমাণে আলাদাভাবে সমৃদ্ধ প্রোটিন থাকে, যা পরামর্শ দেয় যে এই শক্তি এবং রেডক্স পথের ব্যাঘাত রোগের প্রাক-ক্লিনিকাল পর্যায়ে গুরুতর হতে পারে।
আমরা লক্ষ্য করেছি বিভিন্ন মস্তিষ্ক এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড প্যানেল প্রবণতাগুলিরও আকর্ষণীয় জৈবিক প্রভাব রয়েছে। নিউরন সমৃদ্ধ Synapses এবং metabolomes AD মস্তিষ্কে মাত্রা হ্রাস এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের প্রাচুর্য দেখায়। প্রদত্ত যে নিউরনগুলি তাদের অসংখ্য বিশেষ সংকেত (50) এর জন্য শক্তি সরবরাহ করতে সিন্যাপসে শক্তি-উৎপাদনকারী মাইটোকন্ড্রিয়া সমৃদ্ধ, এই দুটি নিউরন গ্রুপের এক্সপ্রেশন প্রোফাইলের মিল প্রত্যাশিত। নিউরনের ক্ষতি এবং ক্ষতিগ্রস্ত কোষের এক্সট্রুশন পরবর্তী রোগে এই মস্তিষ্ক এবং CSF প্যানেলের প্রবণতাগুলি ব্যাখ্যা করতে পারে, তবে তারা আমরা যে প্রাথমিক প্যানেল পরিবর্তনগুলি লক্ষ্য করি তা ব্যাখ্যা করতে পারে না (13)। প্রারম্ভিক অ্যাসিম্পটমেটিক রোগে এই ফলাফলগুলির একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হল অস্বাভাবিক সিনাপটিক ছাঁটাই। মাউস মডেলগুলিতে নতুন প্রমাণগুলি পরামর্শ দেয় যে মাইক্রোগ্লিয়া-মধ্যস্থ সিনাপটিক ফ্যাগোসাইটোসিস AD তে অস্বাভাবিকভাবে সক্রিয় হতে পারে এবং মস্তিষ্কে প্রাথমিক সিন্যাপস ক্ষতির দিকে পরিচালিত করতে পারে (51)। এই বাতিল করা সিন্যাপটিক উপাদান CSF-এ জমা হতে পারে, এই কারণেই আমরা নিউরন প্যানেলে CSF-এর বৃদ্ধি লক্ষ্য করি। ইমিউন-মধ্যস্থ সিনাপটিক ছাঁটাই আংশিকভাবে রোগের প্রক্রিয়া জুড়ে মস্তিষ্ক এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে গ্লিয়াল প্রোটিনের বৃদ্ধিকে ব্যাখ্যা করতে পারে। সিনাপটিক ছাঁটাই ছাড়াও, এক্সোসাইটিক পথের সামগ্রিক অস্বাভাবিকতাও নিউরোনাল মার্কারগুলির বিভিন্ন মস্তিষ্ক এবং CSF প্রকাশের দিকে নিয়ে যেতে পারে। বেশ কয়েকটি গবেষণায় দেখানো হয়েছে যে এডি মস্তিষ্কের প্যাথোজেনেসিসে এক্সোসোমের বিষয়বস্তু পরিবর্তিত হয়েছে (52)। এক্সট্রা সেলুলার পাথওয়ে Aβ (53, 54) এর বিস্তারের সাথে জড়িত। এটি লক্ষণীয় যে এক্সোসোমাল নিঃসরণকে দমন করা AD ট্রান্সজেনিক মাউস মডেলগুলিতে AD-এর মতো প্যাথলজি হ্রাস করতে পারে (55)।
একই সময়ে, ভাস্কুলার প্যানেলে প্রোটিন AD মস্তিষ্কে একটি মাঝারি বৃদ্ধি দেখায়, কিন্তু CSF-এ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়। রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা (BBB) ​​কর্মহীনতা আংশিকভাবে এই ফলাফলগুলি ব্যাখ্যা করতে পারে। অনেক স্বাধীন পোস্টমর্টেম মানব গবেষণা AD (56, 57) সালে BBB ভাঙ্গন প্রদর্শন করেছে। এই গবেষণাগুলি মস্তিষ্কের কৈশিক ফুটো এবং রক্তবাহিত প্রোটিনের পেরিভাসকুলার জমা সহ এন্ডোথেলিয়াল কোষগুলির এই শক্তভাবে সিল করা স্তরকে ঘিরে বিভিন্ন অস্বাভাবিক ক্রিয়াকলাপ নিশ্চিত করেছে (57)। এটি মস্তিষ্কে উন্নত ভাস্কুলার প্রোটিনগুলির জন্য একটি সহজ ব্যাখ্যা প্রদান করতে পারে, তবে এটি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে এই একই প্রোটিনের ক্ষয়কে সম্পূর্ণরূপে ব্যাখ্যা করতে পারে না। একটি সম্ভাবনা হল কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্র সক্রিয়ভাবে এই অণুগুলিকে বর্ধিত প্রদাহ এবং অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের সমস্যা সমাধানের জন্য আলাদা করে দিচ্ছে। এই প্যানেলের সবচেয়ে গুরুতর কিছু CSF প্রোটিনের হ্রাস, বিশেষত যারা লিপোপ্রোটিন নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত, ক্ষতিকারক প্রদাহের মাত্রা এবং প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রক্রিয়ার প্রতিরোধের সাথে সম্পর্কিত। এটি Paroxonase 1 (PON1) এর জন্য সত্য, একটি লাইপোপ্রোটিন বাঁধাই এনজাইম যা সঞ্চালনে অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের মাত্রা হ্রাস করার জন্য দায়ী (58, 59)। আলফা-১-মাইক্রোগ্লোবুলিন/বিকুনিন প্রিকারসার (এএমবিপি) ভাস্কুলার গ্রুপের আরেকটি উল্লেখযোগ্যভাবে নিম্ন-নিয়ন্ত্রিত চিহ্নিতকারী। এটি লিপিড ট্রান্সপোর্টার বিকুনিনের অগ্রদূত, যা প্রদাহ দমন এবং স্নায়বিক সুরক্ষা (60, 61) এর সাথে জড়িত।
বিভিন্ন আকর্ষণীয় অনুমান সত্ত্বেও, জৈব রাসায়নিক রোগের প্রক্রিয়াগুলি সরাসরি সনাক্ত করতে অক্ষমতা আবিষ্কার-চালিত প্রোটিওমিক্স বিশ্লেষণের একটি সুপরিচিত সীমাবদ্ধতা। অতএব, এই বায়োমার্কার প্যানেলগুলির পিছনের প্রক্রিয়াগুলিকে আত্মবিশ্বাসের সাথে সংজ্ঞায়িত করার জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। এমএস-ভিত্তিক ক্লিনিকাল বিশ্লেষণের বিকাশের দিকে অগ্রসর হওয়ার জন্য, ভবিষ্যতের দিকনির্দেশের জন্য বড় আকারের বায়োমার্কার যাচাইকরণের জন্য লক্ষ্যযুক্ত পরিমাণগত পদ্ধতির ব্যবহারও প্রয়োজন, যেমন নির্বাচনী বা সমান্তরাল প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ (62)। আমরা সম্প্রতি এখানে বর্ণিত CSF প্রোটিন পরিবর্তনগুলির অনেকগুলি যাচাই করতে সমান্তরাল প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ (63) ব্যবহার করেছি। YWHAZ, ALDOA, এবং SMOC1 সহ উল্লেখযোগ্য নির্ভুলতার সাথে বেশ কিছু অগ্রাধিকার প্যানেল লক্ষ্যমাত্রা পরিমাপ করা হয়েছে, যা যথাক্রমে আমাদের সিনাপ্স, বিপাক এবং প্রদাহ প্যানেলের মানচিত্র তৈরি করে (63)। স্বাধীন ডেটা অধিগ্রহণ (DIA) এবং অন্যান্য MS-ভিত্তিক কৌশলগুলিও লক্ষ্য যাচাইয়ের জন্য কার্যকর হতে পারে। বুড এট আল। (64) এটি সম্প্রতি প্রদর্শিত হয়েছে যে আমাদের CSF আবিষ্কার ডেটা সেট এবং স্বাধীন DIA-MS ডেটা সেটে চিহ্নিত AD বায়োমার্কারগুলির মধ্যে একটি উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপ রয়েছে, যা তিনটি ভিন্ন ইউরোপীয় দল থেকে প্রায় 200 CSF নমুনা নিয়ে গঠিত। এই সাম্প্রতিক গবেষণাগুলি নির্ভরযোগ্য MS-ভিত্তিক সনাক্তকরণে রূপান্তরিত করার জন্য আমাদের প্যানেলের সম্ভাবনাকে সমর্থন করে। প্রথাগত অ্যান্টিবডি এবং অ্যাপটামার-ভিত্তিক সনাক্তকরণ কী এডি বায়োমার্কারগুলির আরও বিকাশের জন্য গুরুত্বপূর্ণ। CSF এর কম প্রাচুর্যের কারণে, উচ্চ-থ্রুপুট MS পদ্ধতি ব্যবহার করে এই বায়োমার্কারগুলি সনাক্ত করা আরও কঠিন। NEFL এবং NRGN হল কম-প্রাচুর্যের CSF বায়োমার্কারের দুটি উদাহরণ, যা আমাদের ব্যাপক বিশ্লেষণে প্যানেলে ম্যাপ করা হয়েছে, কিন্তু আমাদের একক MS কৌশল ব্যবহার করে নির্ভরযোগ্যভাবে সনাক্ত করা যাবে না। একাধিক অ্যান্টিবডির উপর ভিত্তি করে লক্ষ্য নির্ধারণের কৌশলগুলি, যেমন PEA, এই মার্কারগুলির ক্লিনিকাল রূপান্তরকে উন্নীত করতে পারে।
সামগ্রিকভাবে, এই অধ্যয়নটি বিভিন্ন সিস্টেমের উপর ভিত্তি করে CSF AD বায়োমার্কার সনাক্তকরণ এবং যাচাইকরণের জন্য একটি অনন্য প্রোটোমিক্স পদ্ধতি প্রদান করে। অতিরিক্ত AD কোহর্ট এবং MS প্ল্যাটফর্ম জুড়ে এই মার্কার প্যানেলগুলিকে অপ্টিমাইজ করা AD ঝুঁকি স্তরবিন্যাস এবং চিকিত্সার অগ্রগতির প্রতিশ্রুতিপূর্ণ প্রমাণিত হতে পারে। সময়ের সাথে সাথে এই প্যানেলগুলির অনুদৈর্ঘ্য স্তরের মূল্যায়ন করা অধ্যয়নগুলিও নির্ধারণ করতে গুরুত্বপূর্ণ যে কোন মার্কারগুলির সংমিশ্রণটি প্রাথমিক রোগের ঝুঁকি এবং রোগের তীব্রতার পরিবর্তনকে সর্বোত্তম স্তরীকরণ করে।
CSF দ্বারা অনুলিপি করা 3টি নমুনা বাদে, এই গবেষণায় ব্যবহৃত সমস্ত CSF নমুনা Emory ADRC বা ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত গবেষণা প্রতিষ্ঠানের পৃষ্ঠপোষকতায় সংগ্রহ করা হয়েছিল। এই প্রোটিওমিক্স স্টাডিতে মোট চার সেট এমরি সিএসএফ নমুনা ব্যবহার করা হয়েছিল। CSF কোহর্টে 20 টি সুস্থ নিয়ন্ত্রণ এবং 20 AD রোগীর নমুনা পাওয়া গেছে। CSF কপি 1-এ 32টি সুস্থ নিয়ন্ত্রণ, 31টি AsymAD ব্যক্তি এবং 33 AD ব্যক্তির নমুনা অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। CSF কপি 2-এ 147টি নিয়ন্ত্রণ এবং 150টি AD নমুনা রয়েছে। মাল্টি-ডিজিজ CSF রেপ্লিকেশন 4 কোহর্টে 18 টি কন্ট্রোল, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, এবং 11 FTD নমুনা অন্তর্ভুক্ত ছিল। Emory ইউনিভার্সিটি ইনস্টিটিউশনাল রিভিউ বোর্ড কর্তৃক অনুমোদিত চুক্তি অনুযায়ী, সমস্ত Emory অধ্যয়ন অংশগ্রহণকারীরা অবহিত সম্মতি প্রাপ্ত করেছে। 2014 সালের ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ এজিং বেস্ট প্র্যাকটিস গাইডলাইনস ফর আল্জ্হেইমার্স সেন্টার (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) অনুসারে, সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড কটিদেশীয় পাংচার দ্বারা সংগ্রহ এবং সংরক্ষণ করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ এবং AsymAD এবং AD রোগীরা Emory কগনিটিভ নিউরোলজি ক্লিনিক বা Goizueta ADRC-তে মানসম্মত জ্ঞানীয় মূল্যায়ন পেয়েছেন। তাদের সেরিব্রোস্পাইনাল তরল নমুনা INNO-BIA AlzBio3 Luminex দ্বারা ELISA Aβ1-42, মোট টাউ এবং পি-টাউ বিশ্লেষণ (65) পরীক্ষা করা হয়েছিল। ELISA মানগুলি প্রতিষ্ঠিত AD বায়োমার্কার কাট-অফ মানদণ্ডের (66, 67) উপর ভিত্তি করে বিষয়গুলির ডায়গনিস্টিক শ্রেণীবিভাগকে সমর্থন করতে ব্যবহৃত হয়। অন্যান্য CSF নির্ণয়ের (FTD, ALS, এবং PD) জন্য মৌলিক জনসংখ্যাগত এবং ডায়াগনস্টিক ডেটাও Emory ADRC বা অনুমোদিত গবেষণা প্রতিষ্ঠান থেকে প্রাপ্ত হয়। এই Emory CSF কেসের সারাংশ কেস মেটাডেটা টেবিল S1A-তে পাওয়া যাবে। সুইস সিএসএফ প্রতিলিপি 3 কোহর্টের বৈশিষ্ট্যগুলি পূর্বে প্রকাশিত হয়েছে (45)।
সিএসএফ নমুনা খুঁজে পেয়েছে। CSF ডেটা সেটের আমাদের আবিষ্কারের গভীরতা বাড়ানোর জন্য, ট্রিপসিনাইজেশনের আগে উচ্চ-প্রাচুর্য প্রোটিনের ইমিউন খরচ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 40টি পৃথক CSF নমুনা থেকে 130 μl CSF এবং সমান আয়তনের (130 μl) উচ্চ নির্বাচন টপ14 প্রাচুর্য প্রোটিন হ্রাস রজন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, A36372) একটি স্পিন কলামে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, A8988) রুমে স্থাপন করা হয়েছিল। তাপমাত্রা ইনকিউবেট)। 15 মিনিট ঘোরার পরে, 2 মিনিটের জন্য নমুনাটি 1000g এ সেন্ট্রিফিউজ করুন। একটি 3K আল্ট্রাসেন্ট্রিফিউগাল ফিল্টার ডিভাইস (মিলিপুর, UFC500396) 14,000 গ্রাম 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজিং করে বর্জ্য নমুনাকে ঘনীভূত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। ফসফেট বাফার স্যালাইন দিয়ে সমস্ত নমুনার পরিমাণ 75 μl এ পাতলা করুন। প্রোটিন ঘনত্ব নির্মাতার প্রোটোকল (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) অনুসারে বিসিঙ্কোনিনিক অ্যাসিড (বিসিএ) পদ্ধতি দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সমস্ত 40 টি নমুনা থেকে ইমিউনোডেপ্লেটেড CSF (60 μl) লাইসিল এন্ডোপেপ্টিডেস (LysC) এবং ট্রিপসিন দিয়ে হজম করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, নমুনাটি 1.2 μl 0.5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphine এবং 3 μl 0.8 M ক্লোরোঅ্যাসিটামাইড 90 °C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য কমানো এবং অ্যালকাইলেড করা হয়েছিল এবং তারপরে 15 মিনিটের জন্য জলের স্নানে সোনিক করা হয়েছিল। নমুনাটি 193 μl 8 M ইউরিয়া বাফার [8 M ইউরিয়া এবং 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] দিয়ে 6 M ইউরিয়ার চূড়ান্ত ঘনত্বে পাতলা করা হয়েছিল। LysC (4.5 μg; Wako) ঘরের তাপমাত্রায় রাতারাতি হজমের জন্য ব্যবহৃত হয়। তারপর নমুনাটি 50 মিমি অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট (ABC) (68) দিয়ে 1 এম ইউরিয়াতে মিশ্রিত করা হয়েছিল। সমান পরিমাণে (4.5 μg) ট্রিপসিন (প্রোমেগা) যোগ করুন এবং তারপরে 12 ঘন্টার জন্য নমুনাটি সেঁকুন। 1% ফরমিক অ্যাসিড (FA) এবং 0.1% ট্রাইফ্লুরোএসেটিক অ্যাসিড (TFA) (66) এর চূড়ান্ত ঘনত্বে হজম করা পেপটাইড দ্রবণকে অ্যাসিডিফাই করুন এবং তারপর উপরে বর্ণিত হিসাবে 50 মিলিগ্রাম সেপ-পাক সি18 কলাম (জল) দিয়ে ডিসল্ট করুন (25) . পেপটাইডটি তখন 50% অ্যাসিটোনিট্রিল (ACN) এর 1 মিলি এলুট করা হয়েছিল। ব্যাচ (25) জুড়ে প্রোটিনের পরিমাণকে প্রমিত করার জন্য, সমস্ত 40টি CSF নমুনা থেকে 100 μl অ্যালিকোট একত্রিত করে একটি মিশ্র নমুনা তৈরি করা হয়েছিল, যা তারপরে পাঁচটি গ্লোবাল ইন্টারনাল স্ট্যান্ডার্ড (GIS) (48) নমুনায় ভাগ করা হয়েছিল। সমস্ত স্বতন্ত্র নমুনা এবং মিলিত মান উচ্চ-গতির ভ্যাকুয়াম (ল্যাবকনকো) দ্বারা শুকানো হয়।
CSF নমুনা কপি করে। ডেওন এবং সহকর্মীরা পূর্বে CSF কপি 3 নমুনা (45, 46) এর প্রতিরোধ ক্ষমতা হ্রাস এবং হজমের বর্ণনা করেছেন। অবশিষ্ট প্রতিলিপি নমুনাগুলি পৃথকভাবে ইমিউনোডপ্লেট করা হয়নি। পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ট্রিপসিনে এই অপসারিত নমুনাগুলি হজম করুন (17)। প্রতিটি পুনরাবৃত্ত বিশ্লেষণের জন্য, প্রতিটি নমুনা থেকে এল্যুটেড পেপটাইডের 120 μl অ্যালিকোট একসাথে পুল করা হয়েছিল এবং টিএমটি-লেবেলযুক্ত গ্লোবাল ইন্টারনাল স্ট্যান্ডার্ড (48) হিসাবে ব্যবহার করার জন্য সমান আয়তনের অ্যালিকোটগুলিতে বিভক্ত করা হয়েছিল। সমস্ত স্বতন্ত্র নমুনা এবং মিলিত মান উচ্চ-গতির ভ্যাকুয়াম (ল্যাবকনকো) দ্বারা শুকানো হয়। কম-প্রাচুর্যের CSF প্রোটিনের সংকেত বাড়ানোর জন্য, প্রতিটি নমুনা থেকে 125 μl একত্রিত করে, প্রতিটি প্রতিলিপি বিশ্লেষণের জন্য একটি "বর্ধিত" নমুনা প্রস্তুত করা হয়েছিল [অর্থাৎ, একটি জৈবিক নমুনা যা গবেষণার নমুনার অনুকরণ করে, কিন্তু উপলব্ধ পরিমাণ অনেক বড় (37, 69)] একটি মিশ্র CSF নমুনায় একত্রিত হয়েছে (17)। মিশ্র নমুনাটি তখন 12 মিলি হাই সিলেক্ট টপ14 অ্যাবডেন্স প্রোটিন রিমুভাল রেজিন (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, A36372) ব্যবহার করে ইমিউনোরমোভ করা হয়েছিল, উপরে বর্ণিত হিসাবে হজম করা হয়েছিল এবং পরবর্তী একাধিক টিএমটি লেবেলিংয়ে অন্তর্ভুক্ত ছিল।